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[摘要] 目的 探讨血清ADAMTSL-1蛋白检测在慢性肝病中的临床意义。 方法 收集2016年2～4月在宁波市第二医院肝病中心就诊的80例慢性肝病患者作为实验组，根据Child-Pugh评分分为A级32例，B级30例，C级18例，另外选择24例健康体检者作为正常对照组。检测各组人群血清中的ADAMTSL-1蛋白浓度，并进行统计学分析。 结果 慢性肝病患者的血清ADAMTSL-1蛋白浓度为10.93（9.43～16.36）ng/mL，显著高于正常对照组的7.53（6.91～8.17）ng/mL（t=5.47，P<0.01）；慢性肝病患者血清ADAMTSL-1蛋白浓度随着Child-Pugh评分的升高而增加（F=12.33，P<0.01）。 结论 血清ADAMTSL-1蛋白有可能成为反映慢性肝病患者肝脏储备功能的新指标。
[关键词] ADAMTSL-1；ADAMTS家族；凝血酶敏感蛋白-1；慢性肝病；Child-Pugh评分
[中图分类号] R575 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2016）36-0128-04
[Abstract] Objective To investigate the clinical significance of serum ADAMTSL-1 in chronic liver disease. Methods 80 cases of patients with chronic liver disease admitted to Liver Disease Center in Ningbo No.2 Hospital from February to April 2016 were collected as the experimental group. There were 32 cases of grade A， 30 cases of grade B and 18 cases of grade C according to the Child-Pugh score. In addition， 24 healthy subjects were selected as normal control group. The serum concentration of ADAMTSL-1 protein in each group was detected and analyzed statistically. Results The serum ADAMTSL-1 protein concentration in patients with chronic liver disease was 10.93（9.43-16.36） ng/mL， which was significantly higher than 7.53（6.91-8.17） ng/mL in the control group（t=5.47， P<0.01）. The serum ADAMTSL-1 protein concentration increased with the Child-Pugh score in chronic liver disease patients（F=12.33， P<0.01）. Conclusion Serum ADAMTSL-1 protein may be a new indicator of hepatic reserve function in patients with chronic liver disease.
[Key words] ADAMTSL-1； ADAMTS family； Thrombin sensitive protein-1； Chronic liver diseases； Child-Pugh score
含凝血酶敏感蛋白-1（TSP-1）重復基序的解聚素样金属蛋白酶超家族（ADAMTS super family）包括19种不同的ADAMTS蛋白和至少7种ADAMTS-like（ADAMTSL）蛋白[1]。ADAMTSL除不具有金属蛋白酶和解聚素样结构域外，含有其他ADAMTS的结构域，包括TSP-1。ADAMTSL没有蛋白酶活性，且功能未知，其中一些成员被认为是细胞外基质（EMC）的组成成分[2]。
ADAMTSL-1是该家族的首个成员，是一类分泌性糖蛋白，因其在细胞外基质的分布呈颗粒状而被称为punctin-1[3]。ADAMTSL-1含有4个TSP-1，TSP-1与激活TGF-β关系密切[4]，而TGF-β又与肝病的发生发展相关[5，6]，但目前尚无ADAMTSL-1是否参与肝病进展的相关报道。本文以不同程度（Child-Pugh A、B、C）慢性肝病患者为研究对象，检测血清中ADAMTSL-1蛋白浓度，探讨血清ADAMTSL-1蛋白在慢性肝病中的临床价值。
1 资料与方法
1.1 一般资料
连续收集2016年2～4月在宁波市第二医院肝病中心就诊的各种原因所致的慢性肝病患者80例作为实验组，男50例，女30例，平均年龄（57.49±12.66）岁。所有患者诊断标准依据中华医学会2000年制订的《病毒性肝炎防治方案》，其中，慢性HBV感染者63例，慢性HCV感染者2例，酒精性肝炎/肝硬化9例，药物性肝炎/肝硬化6例。排除标准：（1）确诊或可疑恶性肿瘤；（2）妊娠；（3）合并 HIV感染。根据入院时患者的肝性脑病情况、腹水的有无及其程度、血清总胆红素、血清白蛋白和凝血酶原时间（PT）将肝脏储备功能分为Child-Pugh A、B、C三级（5～6分为A级，7～9分为B级，10～15分为C级），其中A级32例，B级30例，C级18例。另选取24例无肝胆疾病的健康体检者作为对照组，其中男16例，女8例，平均年龄（57.21±11.45）岁。实验组和对照组的性别和年龄具有可比性。本研究由宁波市第二医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。 1.2 检测方法
对所有患者和健康对照组采集5 mL全血标本，1000 g离心15 min后，取上清液并置于-80℃保存。实验前，所有标本室温下复溶后再次离心以备检测。ADAMTSL-1 ELISA试剂盒购自美国Cusabio公司，试剂批号：B24012221。酶标仪型号为德国西门子BEP-Ⅲ。采用生物素-亲和素放大的ELISA（BA-ELISA）检测血清中的ADAMTSL-1蛋白。在预包被抗ADAMTSL-1抗体的微孔板中加入待测血清和标准品，再依次加入生物素化的抗ADAMTSL-1抗体和HRP标记亲和素，最后经底物显色，并在450 nm波长下测定OD值。根据标准曲线求得待测血清ADAMTSL-1浓度。具体操作步骤见试剂说明书。
1.3 统计学处理
ADAMTSL-1浓度为呈偏态分布的计量资料，故用中位数（四分位数）表示，两组和多组均数的比较采用t检验和方差分析（经开平方正态性转换后）。采用SPSS16.0软件分析数据，双侧检验P<0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1 慢性肝病患者和正常对照组血清ADAMTSL-1蛋白比较
80例慢性肝病患者的血清ADAMTSL-1蛋白浓度为10.93（9.43～16.36）ng/mL，显著高于正常对照组的7.53（6.91～8.17）ng/mL（t=5.47，P<0.01）。
2.2血清ADAMTSL-1蛋白在不同Child-Pugh 评分慢性肝病中的比较
血清ADAMTSL-1蛋白浓度随着Child-Pugh评分的升高而增加（F=12.33，P<0.01），经LSD检验，Child-Pugh 评分A、B、C级之间的差异均有统计学意义（P均<0.05）。见图1。
3讨论
到目前为止，已有多个ADAMTS超家族中的成员被发现与肝病发展相关。ADAMTS13是肝脏分泌的一种金属蛋白酶，主要由肝星状细胞合成，其作用是通过降解vWF多聚体减少血栓的形成[7]。Uemura等[8]认为随着肝脏功能的减退ADAMTS13活性和抗原含量逐步降低。而Wiese等[9]的研究发现肝硬化患者的ADAMTS13蛋白含量显著高于对照组，但与Child-Pugh评分、门脉高压和血流动力学无关。以上两项研究的结论看似矛盾，其原因可能与前者研究对象大多为病毒性肝炎肝硬化且采集的血标本为来自外周静脉，而后者病例大多为酒精性肝硬化且血液采集自肝静脉和股动脉有关。另有研究指出慢性乙型和丙型肝炎患者血浆中ADAMTS13活性和含量的升高是发展成肝癌的危险因素[10]。ADAMTS-2、ADAMTS-3和 ADAMTS-14是前胶原N端蛋白酶，可通过剪切N末端前肽使前胶原发展为成熟胶原；三者都可通过裂解转化因子结合蛋白1（Latent TGF-βbinding protein1，LTBP1）、TGF-β受体Ⅲ和前TGF-β而起到调节TGF-β信号的作用[11]。李汉军等[12]也通过免疫组化和Western blot检测到ADAMTS-2和TGF-β1在肝硬化组织中的表达比正常肝组织明显升高，从而推测两者可能存在协同致肝纤维化作用。
在过去的研究中发现ADAMTSL蛋白并不是由ADAMTS基因的剪接变体所产生的，它们由独立的基因编码，如ADAMTSL-1编码基因位于人类染色体9p21-22[3]，ADAMTSL-3编码基因位于人类染色体15等[13]。ADAMTSL-1蛋白含有497个氨基酸，含有1个信号肽、4个TSP-1、1个半胱氨酸富集区域、1个间隔区域和1个N-连接糖基化位点。研究指出ADAMTSL-1蛋白的TSP-1中含有O-连接岩藻糖基化位点和C-甘露糖基化位点，抑制两者糖基化会减少ADAMTSL-1蛋白的分泌。由此推测O-连接岩藻糖基化和C-甘露糖基化可能作为翻译后修饰而影响该蛋白的生成[2，14]。ADAMTSL-1蛋白主要表达在骨骼肌，而其小信使RNA也可见于其他组织（如心脏、结肠、肾脏、肝脏）[3]。Campbell等[15]通過对小鼠骨肉瘤模型注射Hh通路抑制剂IPI-926减弱骨肉瘤的增殖，同时发现ADAMTSL-1表达降低，认为ADAMTSL-1可能作为Hh通路的调控基因改变了骨肉瘤的发展。在秀丽隐杆线虫中，与哺乳动物ADAMTSL-1同源的MADD-4通过导素受体UNC-40/DCC发挥作用[16]。DCC与细胞凋亡和肿瘤形成相关[17，18]，由此也推测ADAMTSL-1参与了肿瘤的发生发展。
到目前为止，包括ADAMTSL-1在内的ADAMTSL蛋白家族功能仍然未知，特别是其与慢性肝病的关系未见有报道。Hirohata等[3]认为这类蛋白可能通过竞争ADAMTS的底物而表现出与ADAMTS蛋白相拮抗。Drechsler等[19]在黑腹果蝇中发现与ADAMTSL同源的Loh可通过与Prc胶原结合而在心肌的细胞外基质形成过程中起关键作用，表明ADAMTSL在进化过程中非常保守，并可能通过与胶原的结合而参与细胞外基质的形成。另一方面，已发现多种ADAMTSL基因突变与疾病相关，如ADAMTSL-4基因突变被认为是常染色体隐性的孤立性晶状体异位（autosomal recessive isolated ectopialentis，IEL）的主要因素[20]；而ADAMTSL-2基因突变与一种表现为身材矮小、指短、皮厚和心瓣膜异常的罕见肌发育不良（geleophysic dysplasia）有关[21]。
原纤蛋白-1（fibrillin-1）是组成细胞外基质的主要成分，与TGF-β关系密切，而后者又是肝硬化最相关的细胞因子。TGF-β可促进原纤蛋白1的表达，而原纤蛋白1参与构成的LTBPs又是活性TGF-β的重要来源[22，23]。ADAMTSL-2、3、6已被发现可以与原纤蛋白1结合，是形成微纤维的重要调节分子[24，25]。Hubmccher等[24]认为ADAMTSL蛋白可能参与了TGF-β的信号通路，提示我们值得对ADAMTSL家族做进一步的研究。 在本研究中，我们发现慢性肝病患者血清中ADAMTSL-1的浓度显著高于健康对照组，且随着Child-Pugh评分的增加而升高，各级之间存在着显著性差异，表明ADAMTSL-1蛋白可能参与慢性肝病的进展。然而本研究也存在一定的缺陷，如（1）病例数较少，尤其是Child-Pugh评分B、C级的患者数量不足；（2）因样本数量的限制未能研究该蛋白与肝癌的相关性。所以未来的研究中我们需进行大样本量实验，并将肝癌患者纳入研究，也许ADAMTSL-1蛋白能成为反映慢性肝病患者肝脏储备功能和预后的新指标。
[参考文献]
[1] Le Goff C，Cormier-Daire V. The ADAMTS（L）family and human genetic disorders[J]. Hum Mol Genet，2011，20（R2）：R163-167.
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[25] Sengle G，Tsutsui K，Keene DR，et al. Microenvironmental regulation by fibrillin-1[J]. PLoS Genet，2012，8（1）：e1002425.
（收稿日期：2016-07-19）
[关键词] ADAMTSL-1；ADAMTS家族；凝血酶敏感蛋白-1；慢性肝病；Child-Pugh评分
[中图分类号] R575 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2016）36-0128-04
[Abstract] Objective To investigate the clinical significance of serum ADAMTSL-1 in chronic liver disease. Methods 80 cases of patients with chronic liver disease admitted to Liver Disease Center in Ningbo No.2 Hospital from February to April 2016 were collected as the experimental group. There were 32 cases of grade A， 30 cases of grade B and 18 cases of grade C according to the Child-Pugh score. In addition， 24 healthy subjects were selected as normal control group. The serum concentration of ADAMTSL-1 protein in each group was detected and analyzed statistically. Results The serum ADAMTSL-1 protein concentration in patients with chronic liver disease was 10.93（9.43-16.36） ng/mL， which was significantly higher than 7.53（6.91-8.17） ng/mL in the control group（t=5.47， P<0.01）. The serum ADAMTSL-1 protein concentration increased with the Child-Pugh score in chronic liver disease patients（F=12.33， P<0.01）. Conclusion Serum ADAMTSL-1 protein may be a new indicator of hepatic reserve function in patients with chronic liver disease.
[Key words] ADAMTSL-1； ADAMTS family； Thrombin sensitive protein-1； Chronic liver diseases； Child-Pugh score
含凝血酶敏感蛋白-1（TSP-1）重復基序的解聚素样金属蛋白酶超家族（ADAMTS super family）包括19种不同的ADAMTS蛋白和至少7种ADAMTS-like（ADAMTSL）蛋白[1]。ADAMTSL除不具有金属蛋白酶和解聚素样结构域外，含有其他ADAMTS的结构域，包括TSP-1。ADAMTSL没有蛋白酶活性，且功能未知，其中一些成员被认为是细胞外基质（EMC）的组成成分[2]。
ADAMTSL-1是该家族的首个成员，是一类分泌性糖蛋白，因其在细胞外基质的分布呈颗粒状而被称为punctin-1[3]。ADAMTSL-1含有4个TSP-1，TSP-1与激活TGF-β关系密切[4]，而TGF-β又与肝病的发生发展相关[5，6]，但目前尚无ADAMTSL-1是否参与肝病进展的相关报道。本文以不同程度（Child-Pugh A、B、C）慢性肝病患者为研究对象，检测血清中ADAMTSL-1蛋白浓度，探讨血清ADAMTSL-1蛋白在慢性肝病中的临床价值。
1 资料与方法
1.1 一般资料
连续收集2016年2～4月在宁波市第二医院肝病中心就诊的各种原因所致的慢性肝病患者80例作为实验组，男50例，女30例，平均年龄（57.49±12.66）岁。所有患者诊断标准依据中华医学会2000年制订的《病毒性肝炎防治方案》，其中，慢性HBV感染者63例，慢性HCV感染者2例，酒精性肝炎/肝硬化9例，药物性肝炎/肝硬化6例。排除标准：（1）确诊或可疑恶性肿瘤；（2）妊娠；（3）合并 HIV感染。根据入院时患者的肝性脑病情况、腹水的有无及其程度、血清总胆红素、血清白蛋白和凝血酶原时间（PT）将肝脏储备功能分为Child-Pugh A、B、C三级（5～6分为A级，7～9分为B级，10～15分为C级），其中A级32例，B级30例，C级18例。另选取24例无肝胆疾病的健康体检者作为对照组，其中男16例，女8例，平均年龄（57.21±11.45）岁。实验组和对照组的性别和年龄具有可比性。本研究由宁波市第二医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。 1.2 检测方法
对所有患者和健康对照组采集5 mL全血标本，1000 g离心15 min后，取上清液并置于-80℃保存。实验前，所有标本室温下复溶后再次离心以备检测。ADAMTSL-1 ELISA试剂盒购自美国Cusabio公司，试剂批号：B24012221。酶标仪型号为德国西门子BEP-Ⅲ。采用生物素-亲和素放大的ELISA（BA-ELISA）检测血清中的ADAMTSL-1蛋白。在预包被抗ADAMTSL-1抗体的微孔板中加入待测血清和标准品，再依次加入生物素化的抗ADAMTSL-1抗体和HRP标记亲和素，最后经底物显色，并在450 nm波长下测定OD值。根据标准曲线求得待测血清ADAMTSL-1浓度。具体操作步骤见试剂说明书。
1.3 统计学处理
ADAMTSL-1浓度为呈偏态分布的计量资料，故用中位数（四分位数）表示，两组和多组均数的比较采用t检验和方差分析（经开平方正态性转换后）。采用SPSS16.0软件分析数据，双侧检验P<0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1 慢性肝病患者和正常对照组血清ADAMTSL-1蛋白比较
80例慢性肝病患者的血清ADAMTSL-1蛋白浓度为10.93（9.43～16.36）ng/mL，显著高于正常对照组的7.53（6.91～8.17）ng/mL（t=5.47，P<0.01）。
2.2血清ADAMTSL-1蛋白在不同Child-Pugh 评分慢性肝病中的比较
血清ADAMTSL-1蛋白浓度随着Child-Pugh评分的升高而增加（F=12.33，P<0.01），经LSD检验，Child-Pugh 评分A、B、C级之间的差异均有统计学意义（P均<0.05）。见图1。
3讨论
到目前为止，已有多个ADAMTS超家族中的成员被发现与肝病发展相关。ADAMTS13是肝脏分泌的一种金属蛋白酶，主要由肝星状细胞合成，其作用是通过降解vWF多聚体减少血栓的形成[7]。Uemura等[8]认为随着肝脏功能的减退ADAMTS13活性和抗原含量逐步降低。而Wiese等[9]的研究发现肝硬化患者的ADAMTS13蛋白含量显著高于对照组，但与Child-Pugh评分、门脉高压和血流动力学无关。以上两项研究的结论看似矛盾，其原因可能与前者研究对象大多为病毒性肝炎肝硬化且采集的血标本为来自外周静脉，而后者病例大多为酒精性肝硬化且血液采集自肝静脉和股动脉有关。另有研究指出慢性乙型和丙型肝炎患者血浆中ADAMTS13活性和含量的升高是发展成肝癌的危险因素[10]。ADAMTS-2、ADAMTS-3和 ADAMTS-14是前胶原N端蛋白酶，可通过剪切N末端前肽使前胶原发展为成熟胶原；三者都可通过裂解转化因子结合蛋白1（Latent TGF-βbinding protein1，LTBP1）、TGF-β受体Ⅲ和前TGF-β而起到调节TGF-β信号的作用[11]。李汉军等[12]也通过免疫组化和Western blot检测到ADAMTS-2和TGF-β1在肝硬化组织中的表达比正常肝组织明显升高，从而推测两者可能存在协同致肝纤维化作用。
在过去的研究中发现ADAMTSL蛋白并不是由ADAMTS基因的剪接变体所产生的，它们由独立的基因编码，如ADAMTSL-1编码基因位于人类染色体9p21-22[3]，ADAMTSL-3编码基因位于人类染色体15等[13]。ADAMTSL-1蛋白含有497个氨基酸，含有1个信号肽、4个TSP-1、1个半胱氨酸富集区域、1个间隔区域和1个N-连接糖基化位点。研究指出ADAMTSL-1蛋白的TSP-1中含有O-连接岩藻糖基化位点和C-甘露糖基化位点，抑制两者糖基化会减少ADAMTSL-1蛋白的分泌。由此推测O-连接岩藻糖基化和C-甘露糖基化可能作为翻译后修饰而影响该蛋白的生成[2，14]。ADAMTSL-1蛋白主要表达在骨骼肌，而其小信使RNA也可见于其他组织（如心脏、结肠、肾脏、肝脏）[3]。Campbell等[15]通過对小鼠骨肉瘤模型注射Hh通路抑制剂IPI-926减弱骨肉瘤的增殖，同时发现ADAMTSL-1表达降低，认为ADAMTSL-1可能作为Hh通路的调控基因改变了骨肉瘤的发展。在秀丽隐杆线虫中，与哺乳动物ADAMTSL-1同源的MADD-4通过导素受体UNC-40/DCC发挥作用[16]。DCC与细胞凋亡和肿瘤形成相关[17，18]，由此也推测ADAMTSL-1参与了肿瘤的发生发展。
到目前为止，包括ADAMTSL-1在内的ADAMTSL蛋白家族功能仍然未知，特别是其与慢性肝病的关系未见有报道。Hirohata等[3]认为这类蛋白可能通过竞争ADAMTS的底物而表现出与ADAMTS蛋白相拮抗。Drechsler等[19]在黑腹果蝇中发现与ADAMTSL同源的Loh可通过与Prc胶原结合而在心肌的细胞外基质形成过程中起关键作用，表明ADAMTSL在进化过程中非常保守，并可能通过与胶原的结合而参与细胞外基质的形成。另一方面，已发现多种ADAMTSL基因突变与疾病相关，如ADAMTSL-4基因突变被认为是常染色体隐性的孤立性晶状体异位（autosomal recessive isolated ectopialentis，IEL）的主要因素[20]；而ADAMTSL-2基因突变与一种表现为身材矮小、指短、皮厚和心瓣膜异常的罕见肌发育不良（geleophysic dysplasia）有关[21]。
原纤蛋白-1（fibrillin-1）是组成细胞外基质的主要成分，与TGF-β关系密切，而后者又是肝硬化最相关的细胞因子。TGF-β可促进原纤蛋白1的表达，而原纤蛋白1参与构成的LTBPs又是活性TGF-β的重要来源[22，23]。ADAMTSL-2、3、6已被发现可以与原纤蛋白1结合，是形成微纤维的重要调节分子[24，25]。Hubmccher等[24]认为ADAMTSL蛋白可能参与了TGF-β的信号通路，提示我们值得对ADAMTSL家族做进一步的研究。 在本研究中，我们发现慢性肝病患者血清中ADAMTSL-1的浓度显著高于健康对照组，且随着Child-Pugh评分的增加而升高，各级之间存在着显著性差异，表明ADAMTSL-1蛋白可能参与慢性肝病的进展。然而本研究也存在一定的缺陷，如（1）病例数较少，尤其是Child-Pugh评分B、C级的患者数量不足；（2）因样本数量的限制未能研究该蛋白与肝癌的相关性。所以未来的研究中我们需进行大样本量实验，并将肝癌患者纳入研究，也许ADAMTSL-1蛋白能成为反映慢性肝病患者肝脏储备功能和预后的新指标。
[参考文献]
[1] Le Goff C，Cormier-Daire V. The ADAMTS（L）family and human genetic disorders[J]. Hum Mol Genet，2011，20（R2）：R163-167.
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[3] Hirohata S，Wang LW，Miyagi M，et al. Punctin，a novel ADAMTS-like molecule，ADAMTSL-1，in extracellular matrix[J]. J Biol Chem，2002，277（14）：12182-12189.
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（收稿日期：2016-07-19）