论文部分内容阅读
摘 要： 目的 比较两种方法提取粪便细菌基因组DNA的效果。方法 收集30例健康人的粪便，采用改进的液氮冻融法及试剂盒法提取DNA，对总产量和纯度进行分析。PCR扩增细菌16S rDNA基因序列，比较不同方法提取人粪便基因组DNA效率的差异。结果 采用改进的液氮冻融法提取和试剂盒法提取的DNA浓度分别为784±69.13 ng/μl、209.98±39.30 ng/μl（F=505.085，P<0.001）。结论 试剂盒法在提取基因组DNA纯度优于改进液氮冻融法。但改进液氮冻融法的优点是提取基因组DNA浓度高，满足后期使用条件的前提下，提取费用相对较低。
关键词： 粪便；细菌基因组DNA；聚合酶链式反应
【中图分类号】G710
一 材料与方法
1 样品的采集与储存
以灭菌过的粪便取样盒采集30份体检正常的20-30岁志愿者的新鲜粪便样本，并在采集后30 min内送至实验室，于-20 ℃冻存，备用。
2 粪便细菌基因组DNA提取方法
改进的液氮冻融法：粪便前处理[2]：称取200 mg粪便，加入30 mL PBS涡旋震荡，使样本均匀浑浊。200×g离心5 min，收集上清弃去沉淀。重复洗涤3次。9000×g离心5 min，重复洗涤3次。倒弃上清，留沉淀。加入4 mL PBS缓冲液，取1 mL移入1.5 mL离心管中，-20 ℃冻存。DNA提取：8000×g离心5 min，倒弃上清收集沉淀。加入500 μL TE缓冲液，震荡重悬。至液氮中冻结，取出后放入65 ℃水浴融化，反复冻融3次。再加入60 μL 10%SDS和2 μL 100 mg/mL RNase A，55 ℃水浴30 min。加入10 μL 蛋白酶K，混匀后于37 ℃摇床摇4 h。加80 μL CTAB和80 μL NaCl，混匀65 ℃水浴20 min。加750 μL苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），12000×g离心10 min。取上清，加750 μL氯仿：异戊醇（24：1），。12000×g离心10 min，取上清，重复上述步骤。在上清液中加500 μL预冷异丙醇混合。12000×g离心10 min，弃去上清，在沉淀中加1 mL 75%乙醇冲洗沉淀。在室温中晾干乙醇。用60 μL TE溶解DNA。4 ℃放置过夜后置于-20 ℃冻存。
粪便基因组DNA提取试剂盒法：按TIANamp Stool DNA Kit 说明书进行。
3 DNA溶液浓度及纯度测定
粪便总DNA通过紫外微量分光光度计定量检测提取DNA浓度，用OD260/280检测提取DNA的纯度。
4 提取DNA的PCR有效性分析
PCR反应条件：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性45 sec，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min（20个循环）；95 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min（10个循环），72 ℃ 再延伸10 min。
将PCR产物采用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，EB染色，150 v/cm，15 min。用凝胶成像照相分析。
5 统计学方法
应用SPSS13.0统计软件进行数据处理，计数资料采用T检验比较，P <0.05为差异有统计学意义。
二 结果
1 不同方法提取粪便细菌基因组DNA产物纯度和浓度比较结果
结果显示不同方法提取的粪便DNA浓度在各组间均有显著性差（P<0.001）。在提取DNA的纯度上，OD值在1.8-2.0范围内较好。改进液氮冻融法和试剂盒法的产物纯度（OD260/280）是2.11±0.10，1.89±0.05。改进液氮冻融法和试剂盒法的产物产物浓度是 784±69.13ng/μL，209.98±39.3ng/μL。
效性分析结果
2 不同方法提取粪便细菌基因组DNA产物的PCR有
在200bp处可扩增出特异性条带。粪便DNA提取试剂盒提取的DNA有清晰明亮的条带。改进液氮冻融法提取的DNA条带亮度很大，但个别有拖尾现象。
3 不同方法提取粪便细菌基因组DNA产物所耗时间和费用对比分析结果
改进液氮冻融法用时15h，每个成本6元；试剂盒法用时2.5h，每个样品成本19.6元。液氮凍融法提取粪便DNA前需要对粪便样品进行前处理清洗，所以操作所耗时间延长，成本较低。而目前试剂盒提取方法工作效率较高， 但成本也相应提高。
三 讨论
结合本实验中改进的液氮冻融法，利用PBS缓冲液对冻存粪便进行预处理，结果得到了高浓度的DNA产物相对试剂盒法，但产物纯度没有得到提升。试剂盒法提取的产物浓度适中，提取产物纯度较好。但由于成本和耗时的差异，使得此种方法的选择要根据各自实验的特点来进行。在探讨粪便DNA的PCR有效性上，液氮冻融法的提取稳定性较好，如果加大核糖核酸酶的使用量会减少RNA污染及电泳条带拖尾现象，从而避免使用相对价格昂贵的试剂盒，使粪便DNA检测更具廉价性。从粪便中提取高质量肠道菌群总基因组DNA是研究分析肠道菌群与相关疾病发生机制的基础和前提。粪便样品中含有大量肠道菌，同时也含有各种肠道脱落细胞、腐殖质及多种无机物和有机物等[3]。液氮冻融法经过改进比以前的方法在浓度和纯度上有进一步提升。由于目前粪便提取基因组DNA试剂盒在提取产物纯度和质量上的稳定性，提高了粪便DNA提取效率的同时对肠道菌群DNA产物的测序工作奠定了研究基础。综上所述，建议实验室根据具体实验要求和特点、经费支持情况、人力物力来合理选择粪便DNA提取方法。
参 考 文 献
[1] 刘伟伟，严敏，周丽萍，等.肥胖与肠道菌群的相关性[J].生命的化学，2009，29（6）：928-932.
[2] 徐洁.四川地区不同年龄健康人肠道菌群的比较研究[D].内蒙古农业大学，2012.
[3] 郑晓皎.肠道菌-宿主代谢物组的分析平台的建立及应用[D].上海交通大学，2013.
关键词： 粪便；细菌基因组DNA；聚合酶链式反应
【中图分类号】G710
一 材料与方法
1 样品的采集与储存
以灭菌过的粪便取样盒采集30份体检正常的20-30岁志愿者的新鲜粪便样本，并在采集后30 min内送至实验室，于-20 ℃冻存，备用。
2 粪便细菌基因组DNA提取方法
改进的液氮冻融法：粪便前处理[2]：称取200 mg粪便，加入30 mL PBS涡旋震荡，使样本均匀浑浊。200×g离心5 min，收集上清弃去沉淀。重复洗涤3次。9000×g离心5 min，重复洗涤3次。倒弃上清，留沉淀。加入4 mL PBS缓冲液，取1 mL移入1.5 mL离心管中，-20 ℃冻存。DNA提取：8000×g离心5 min，倒弃上清收集沉淀。加入500 μL TE缓冲液，震荡重悬。至液氮中冻结，取出后放入65 ℃水浴融化，反复冻融3次。再加入60 μL 10%SDS和2 μL 100 mg/mL RNase A，55 ℃水浴30 min。加入10 μL 蛋白酶K，混匀后于37 ℃摇床摇4 h。加80 μL CTAB和80 μL NaCl，混匀65 ℃水浴20 min。加750 μL苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），12000×g离心10 min。取上清，加750 μL氯仿：异戊醇（24：1），。12000×g离心10 min，取上清，重复上述步骤。在上清液中加500 μL预冷异丙醇混合。12000×g离心10 min，弃去上清，在沉淀中加1 mL 75%乙醇冲洗沉淀。在室温中晾干乙醇。用60 μL TE溶解DNA。4 ℃放置过夜后置于-20 ℃冻存。
粪便基因组DNA提取试剂盒法：按TIANamp Stool DNA Kit 说明书进行。
3 DNA溶液浓度及纯度测定
粪便总DNA通过紫外微量分光光度计定量检测提取DNA浓度，用OD260/280检测提取DNA的纯度。
4 提取DNA的PCR有效性分析
PCR反应条件：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性45 sec，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min（20个循环）；95 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min（10个循环），72 ℃ 再延伸10 min。
将PCR产物采用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，EB染色，150 v/cm，15 min。用凝胶成像照相分析。
5 统计学方法
应用SPSS13.0统计软件进行数据处理，计数资料采用T检验比较，P <0.05为差异有统计学意义。
二 结果
1 不同方法提取粪便细菌基因组DNA产物纯度和浓度比较结果
结果显示不同方法提取的粪便DNA浓度在各组间均有显著性差（P<0.001）。在提取DNA的纯度上，OD值在1.8-2.0范围内较好。改进液氮冻融法和试剂盒法的产物纯度（OD260/280）是2.11±0.10，1.89±0.05。改进液氮冻融法和试剂盒法的产物产物浓度是 784±69.13ng/μL，209.98±39.3ng/μL。
效性分析结果
2 不同方法提取粪便细菌基因组DNA产物的PCR有
在200bp处可扩增出特异性条带。粪便DNA提取试剂盒提取的DNA有清晰明亮的条带。改进液氮冻融法提取的DNA条带亮度很大，但个别有拖尾现象。
3 不同方法提取粪便细菌基因组DNA产物所耗时间和费用对比分析结果
改进液氮冻融法用时15h，每个成本6元；试剂盒法用时2.5h，每个样品成本19.6元。液氮凍融法提取粪便DNA前需要对粪便样品进行前处理清洗，所以操作所耗时间延长，成本较低。而目前试剂盒提取方法工作效率较高， 但成本也相应提高。
三 讨论
结合本实验中改进的液氮冻融法，利用PBS缓冲液对冻存粪便进行预处理，结果得到了高浓度的DNA产物相对试剂盒法，但产物纯度没有得到提升。试剂盒法提取的产物浓度适中，提取产物纯度较好。但由于成本和耗时的差异，使得此种方法的选择要根据各自实验的特点来进行。在探讨粪便DNA的PCR有效性上，液氮冻融法的提取稳定性较好，如果加大核糖核酸酶的使用量会减少RNA污染及电泳条带拖尾现象，从而避免使用相对价格昂贵的试剂盒，使粪便DNA检测更具廉价性。从粪便中提取高质量肠道菌群总基因组DNA是研究分析肠道菌群与相关疾病发生机制的基础和前提。粪便样品中含有大量肠道菌，同时也含有各种肠道脱落细胞、腐殖质及多种无机物和有机物等[3]。液氮冻融法经过改进比以前的方法在浓度和纯度上有进一步提升。由于目前粪便提取基因组DNA试剂盒在提取产物纯度和质量上的稳定性，提高了粪便DNA提取效率的同时对肠道菌群DNA产物的测序工作奠定了研究基础。综上所述，建议实验室根据具体实验要求和特点、经费支持情况、人力物力来合理选择粪便DNA提取方法。
参 考 文 献
[1] 刘伟伟，严敏，周丽萍，等.肥胖与肠道菌群的相关性[J].生命的化学，2009，29（6）：928-932.
[2] 徐洁.四川地区不同年龄健康人肠道菌群的比较研究[D].内蒙古农业大学，2012.
[3] 郑晓皎.肠道菌-宿主代谢物组的分析平台的建立及应用[D].上海交通大学，2013.