论文部分内容阅读
大肠菌群是食品微生物安全中的重要检测指标之一，目前国内外食品检测和饮用水检测均需要检测大肠菌群。传统的检测方法费时费力，操作繁琐。特异性酶底物合成和应用发展迅速，已经广泛应用于微生物检测。特别是近年来特异性显色培养基已逐渐为食品安全检测所采用。4-甲基伞形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷(MUGal)是食品安全中重要指示菌大肠菌群的特异性快速检测荧光底物。GB/T4789.32-2002食品卫生微生物检验大肠菌群的快速检测就是利用MUGal来实现大肠菌群的检测，该法克服了传统检测法中对目标菌进行培养后还需要一系列繁琐的验证实验的缺点，实现了一步培养直接鉴定。国外相关技术已经发展的比较成熟，而且已有商品化的大肠菌群显色培养基，但是我国关于这方面的研究报道很少。目前国内所需荧光底物大多需要依赖进口，价格昂贵，严重制约着我国在利用显色培养基技术检测微生物方面的发展。 根据微生物代谢过程中产生的特异性酶设计特异性酶底物，利用特异性酶底物和特异性酶的特异性作用检测目标菌，直接观察培养基中颜色变化等现象，从而可以实现对目标菌的检测。本文研究了MUGal的合成方法并将其应用于大肠菌群的检测，为MUGal的批量合成和应用打下了良好基础。 1.改进传统的合成方法Koenigs-Knorr法，运用相转移催化法使四乙酰基-α-D-溴代半乳糖和4-甲基伞形酮缩合生成保护的糖苷。具体研究了温度、时间、相转移催化剂用量对糖苷化一步产率的影响，通过正交试验，得到最佳反应条件，糖苷化一步产率最高达73.12％。制备的底物经IR、1HNMR以及13CNMR确定了结构。解决了产率低和反应时间长的问题。 2.在糖苷化最佳条件下将浓缩所得棕色黏稠状液体不经分离直接加入碳酸钠的甲醇溶液，去保护得到MUGal。该方法省去硅胶柱层析，简化了操作步骤，大大节省了时间。 3.将制备底物应用于大肠菌群显色培养基并和进口底物（APOLLO公司）比较，标准菌株在本文合成的MUGal制备的肉汤和采用APOLLO产的MUGal制备的肉汤中的产荧光情况是一致的;用本文合成的MUGal肉汤和APOLLO产MUGal肉汤以MPN法检测十份样品，两种肉汤产荧光管数经X2检验(P＞0.05)无显著性差异。本文制备的MUGal可以作为进口底物的替代品。 本文研究了MUGal的实验室合成工艺，并初步研究了制备产物的显色效果，为荧光底物的商品化应用和荧光底物的批量合成打下了良好基础。