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活性氧等自由基诱导机体产生的氧化应激与人体多种慢性疾病的发生发展关系密切。以槲皮素为代表的天然抗氧化功能因子具有清除自由基及上调机体抗氧化酶系统活性的作用,对机体氧化还原状态的调节有积极意义。但随着研究的深入,越来越多的研究发现槲皮素在高浓度、长时间作用时会造成机体ROS水平升高,抗氧化酶活性下降等。因此研究槲皮素促进细胞氧化应激的机制,对更安全地应用槲皮素具有重要意义。本研究利用可稳定诱导ROS产生的AAPH(2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐)作为氧化剂,在HepG2细胞内建立氧化应激模型,并将AAPH与槲皮素在化学体系中反应生成槲皮素氧化产物,探究不同浓度的槲皮素及其氧化产物对细胞氧化应激的影响及可能的作用机制。本研究用不同浓度槲皮素孵育正常或AAPH氧化损伤的HepG2细胞,测定细胞存活率、胞内ROS水平、氧化还原状态相关指标,结果表明槲皮素在低浓度(≤10μmol/L)、短时间(≤24 h)孵育细胞可以显著提高T-AOC水平及SOD、CAT、GSH-Px三种抗氧化酶活力、GSH含量、GSH/GSSG比值及细胞存活率,降低细胞ROS水平以及MDA含量(P<0.05),对细胞起抗氧化作用;而随着孵育浓度及时间的增加,细胞存活率出现显著下降,ROS水平及MDA含量显著升高,细胞的抗氧化指标均显著降低(P<0.05),且各浓度槲皮素孵育的AAPH损伤细胞组ROS水平均显著高于同浓度的正常细胞组,说明这可能与AAPH加速了细胞中槲皮素氧化产物的生成与积累有关,而槲皮素在清除自由基过程中新生成的氧化产物可能对细胞具有更强的促氧化应激作用。为了探究槲皮素氧化产物是否比槲皮素更显著地促进了细胞的氧化应激,本研究以AAPH和槲皮素在37℃下反应12 h生成槲皮素-AAPH氧化产物,用紫外-可见波长扫描及HPLC-MS鉴定分析所得氧化产物的结构,并以氧化产物孵育Hep G2细胞,对细胞存活率、ROS水平及抗氧化还原指标进行测定。结果显示,AAPH与槲皮素反应12h后的产物于294 nm处有特征吸收,LC-MS解析结果表明该体系反应生成了4种主要的氧化产物,相对分子质量分别为:154、170、350及300;与槲皮素处理的细胞组相比,100μmol/L槲皮素氧化产物显著降低细胞的存活率(P<0.05),升高ROS水平,降低细胞T-AOC、CAT、GSH-Px、SOD活性、GSH含量及GSH/GSSG,升高MDA水平,说明高浓度的槲皮素在自由基的清除过程中所生成的氧化产物对细胞的氧化应激具有更强的促进作用,槲皮素氧化产物可能是槲皮素促氧化的活性形式。最后,为探究槲皮素氧化产物在加剧细胞氧化应激过程中,对细胞氧化还原相关基因通路的影响,采用荧光定量PCR法测定以上三种不同孵育模型对相关基因的mRNA表达水平的影响。结果显示,三种孵育模型下,低浓度的槲皮素或其氧化产物均可以显著上调抗氧化基因Nrf2,HO-1、NQO-1、Prdx,下调Keap-1、Nox-2、Cox-2基因mRNA表达水平(P<0.05);但以100μmol/L的高浓度孵育细胞,相关抗氧化基因的表达会受到抑制,促氧化基因表达显著上调(P<0.05),三种模型中槲皮素氧化产物对基因表达的影响最显著(P<0.01),且AAPH氧化损伤组对Nrf2、HO-1及NQO-1表达的下调作用均比正常细胞组更显著(P<0.05)。结果说明,不同孵育模型下,槲皮素对细胞氧化还原相关基因mRNA的表达有显著差异,这很可能与不同孵育条件下细胞内槲皮素氧化产物的含量有关。综上所述,槲皮素在低浓度、短时间孵育时,可以对细胞起到一定的抗氧化保护作用,但随着槲皮素浓度及孵育时间的增加,细胞的存活率下降,ROS水平显著增加,槲皮素对细胞的作用由抗氧化向促氧化转变。高浓度槲皮素可能通过在清除自由基过程中生成的大量槲皮素氧化产物来降低HepG2细胞的抗氧化活性,并促进HepG2细胞的氧化应激,而槲皮素氧化产物主要通过消耗GSH及下调Nrf2抗氧化信号通路表达和相关抗氧化酶活性的来加剧细胞氧化应激的发生发展。高浓度的槲皮素对细胞具有一定的促氧化作用,因此,将槲皮素开发为膳食补充剂时,需要对其剂量-效应关系进行更深入的研究。