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乳腺的发育随着动物的生殖及泌乳周期经历生长、分化及退化等周期性变化，乳腺上皮细胞的增殖和凋亡贯穿于泌乳的整个过程。乳腺上皮细胞能合成和分泌乳蛋白，其数量及单个细胞的泌乳能力是决定奶牛产奶量的重要因素。长链非编码RNA(Long noncoding RNAs, lncRNAs)和microRNA(miRNAs)通过调控基因的表达，参与乳腺发育及泌乳过程。课题组前期对泌乳期和干奶期的奶牛乳腺组织RNA-Seq测序分析结果表明，TCONS-71659(命名为lncRNAMPNCR，mammaryproliferation-associatedlongnoncodingRNA)泌乳期表达量显著高于干奶期，推测该lncRNA参与奶牛的泌乳调控。因此，本研究以奶牛乳腺上皮细胞系(BMECs)为研究对象，首先通过MTT及EdU试验，探究lncRNAMPNCR对奶牛乳腺上皮细胞活力和增殖的影响，并通过RT-qPCR和WesternBlot试验，对其可能作为内源性竞争RNA(ceRNA)参与奶牛乳腺上皮细胞的增殖调控机制进行了探究，获得的结果如下：
1.为确定lncRNAMPNCR在奶牛乳腺上皮细胞中的作用，分别向BMECs中转染pcDNA3.1(+)-lncRNAMPNCR载体与pcDNA3.1(+)空载体。MTT试验结果显示，与对照组相比，过表达lncRNAMPNCR显著抑制BMECs的细胞活力(P＜0.01)；EdU结果表明，过表达lncRNAMPNCR后,显著抑制了奶牛乳腺上皮细胞的增殖(P＜0.01)。
2.为确定lncRNAMPNCR影响奶牛乳腺上皮细胞增殖的调控机制，对lncRNAMPNCR进行亚细胞定位，结果显示lncRNAMPNCR在细胞核和细胞质中均有表达。生物信息学软件分析显示miR-31与lncRNAMPNCR之间存在结合位点，通过双荧光素酶试验及RT-qPCR探究lncRNAMPNCR与miR-31的相关性。双荧光素酶试验结果表明，与miR-31mimic-NC组相比，转染miR-31mimic组显著降低lncRNAMPNCR的荧光活性比(海肾酶活/荧火虫酶活，R/F)(P＜0.05)。RT-qPCR结果显示，在BMECs中转染pcDNA3.1(+)-lncRNAMPNCR载体显著抑制miR-31的表达(P＜0.01)。且过表达miR-31后，lncRNAMPNCR的表达水平显著下降(P＜0.01)；抑制miR-31的表达后，lncRNAMPNCR表达量显著提高(P＜0.05)，表明lncRNAMPNCR调控miR-31的表达。
3.为确定miR-31的功能及靶基因，向BMECs中分别转染miR-31mimic(或mimic-NC)和miR-31inhibitor(或inhibitor-NC)。MTT结果表明，与对照组相比，过表达miR-31显著提高了奶牛乳腺上皮细胞活力(P＜0.01)，抑制miR-31的表达后显著抑制了细胞活力(P＜0.05)。EdU试验结果表明，miR-31mimic组显著促进了BMECs增殖(P＜0.01)，而miR-31inhibitor组显著抑制了细胞的增殖。双荧光素酶试验显示，miR-31显著抑制CAMK2D3’UTR的双荧光酶活比值(海肾酶活/萤火虫酶活,R/F)(P＜0.01)。RT-qPCR及WesternBlot结果显示，过表达miR-31显著抑制CAMK2D的表达(P＜0.01)，而抑制miR-31的表达后，CAMK2D的表达显著提高(P＜0.05)。上述试验结果表明，CAMK2D是miR-31的靶基因。
4、为探究lncRNAMPNCR对CAMK2D的调控作用，向BMECs中转染pcDNA3.1(+)-lncRNAMPNCR载体与pcDNA3.1(+)空载体。RT-qPCR及WesternBlot结果显示，过表达lncRNAMPNCR显著提高了靶基因CAMK2D在mRNA及蛋白水平的表达量(P＜0.01)。将pcDNA3.1(+)-lncRNAMPNCR和miR-31mimic共转染的功能回复试验进一步表明，lncRNAMPNCR通过靶向结合miR-31抑制奶牛乳腺上皮细胞的增殖(P＜0.05)。
综上所述，在奶牛乳腺上皮细胞中，lncRNAMPNCR通过吸附抑制miR-31的表达，进而调节miR-31下游增殖相关靶基因CAMK2D的表达，即lncRNAMPNCR作为miR-31的ceRNA抑制奶牛乳腺上皮细胞的增殖。本研究以lncRNAMPNCR为出发点，揭示了其在奶牛乳腺上皮细胞中的作用与机制，通过与其相关联的miRNA及靶基因，探究三者的调控关系，为深入探究lncRNA对奶牛乳腺上皮细胞的调控机理提供理论依据。
1.为确定lncRNAMPNCR在奶牛乳腺上皮细胞中的作用，分别向BMECs中转染pcDNA3.1(+)-lncRNAMPNCR载体与pcDNA3.1(+)空载体。MTT试验结果显示，与对照组相比，过表达lncRNAMPNCR显著抑制BMECs的细胞活力(P＜0.01)；EdU结果表明，过表达lncRNAMPNCR后,显著抑制了奶牛乳腺上皮细胞的增殖(P＜0.01)。
2.为确定lncRNAMPNCR影响奶牛乳腺上皮细胞增殖的调控机制，对lncRNAMPNCR进行亚细胞定位，结果显示lncRNAMPNCR在细胞核和细胞质中均有表达。生物信息学软件分析显示miR-31与lncRNAMPNCR之间存在结合位点，通过双荧光素酶试验及RT-qPCR探究lncRNAMPNCR与miR-31的相关性。双荧光素酶试验结果表明，与miR-31mimic-NC组相比，转染miR-31mimic组显著降低lncRNAMPNCR的荧光活性比(海肾酶活/荧火虫酶活，R/F)(P＜0.05)。RT-qPCR结果显示，在BMECs中转染pcDNA3.1(+)-lncRNAMPNCR载体显著抑制miR-31的表达(P＜0.01)。且过表达miR-31后，lncRNAMPNCR的表达水平显著下降(P＜0.01)；抑制miR-31的表达后，lncRNAMPNCR表达量显著提高(P＜0.05)，表明lncRNAMPNCR调控miR-31的表达。
3.为确定miR-31的功能及靶基因，向BMECs中分别转染miR-31mimic(或mimic-NC)和miR-31inhibitor(或inhibitor-NC)。MTT结果表明，与对照组相比，过表达miR-31显著提高了奶牛乳腺上皮细胞活力(P＜0.01)，抑制miR-31的表达后显著抑制了细胞活力(P＜0.05)。EdU试验结果表明，miR-31mimic组显著促进了BMECs增殖(P＜0.01)，而miR-31inhibitor组显著抑制了细胞的增殖。双荧光素酶试验显示，miR-31显著抑制CAMK2D3’UTR的双荧光酶活比值(海肾酶活/萤火虫酶活,R/F)(P＜0.01)。RT-qPCR及WesternBlot结果显示，过表达miR-31显著抑制CAMK2D的表达(P＜0.01)，而抑制miR-31的表达后，CAMK2D的表达显著提高(P＜0.05)。上述试验结果表明，CAMK2D是miR-31的靶基因。
4、为探究lncRNAMPNCR对CAMK2D的调控作用，向BMECs中转染pcDNA3.1(+)-lncRNAMPNCR载体与pcDNA3.1(+)空载体。RT-qPCR及WesternBlot结果显示，过表达lncRNAMPNCR显著提高了靶基因CAMK2D在mRNA及蛋白水平的表达量(P＜0.01)。将pcDNA3.1(+)-lncRNAMPNCR和miR-31mimic共转染的功能回复试验进一步表明，lncRNAMPNCR通过靶向结合miR-31抑制奶牛乳腺上皮细胞的增殖(P＜0.05)。
综上所述，在奶牛乳腺上皮细胞中，lncRNAMPNCR通过吸附抑制miR-31的表达，进而调节miR-31下游增殖相关靶基因CAMK2D的表达，即lncRNAMPNCR作为miR-31的ceRNA抑制奶牛乳腺上皮细胞的增殖。本研究以lncRNAMPNCR为出发点，揭示了其在奶牛乳腺上皮细胞中的作用与机制，通过与其相关联的miRNA及靶基因，探究三者的调控关系，为深入探究lncRNA对奶牛乳腺上皮细胞的调控机理提供理论依据。