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美国白蛾（Hyphantria cunea）是重要的检疫害虫，喜食桑树、杨树等经济林木和其它农作物，是农林业生产的大敌，被列为中国首批外来入侵物种。生物防治相对安全、残留少、不易产生抗药性，是防控美国白蛾的重要防治措施。苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）杀虫蛋白与昆虫中肠上受体的结合是毒素发挥作用的关键环节。为了明确Bt蛋白对美国白蛾的作用机制，从而延缓抗性产生，本文克隆并鉴定了美国白蛾中肠受体蛋白碱性磷酸酶全长基因hcalp1、hcalp3，对HcALP1、HcALP3蛋白与Bt Cry1Ab35、Cry1Ac和Cry9Ea10的结合及组织表达特异性进行了分析，对美国白蛾碱性磷酸酶HcALPs在Bt Cry蛋白作用机制中的功能进行了研究。主要结果如下:
1.根据美国白蛾中肠转录组数据获得碱性磷酸酶序列，设计特异引物，PCR扩增得到美国白蛾中肠碱性磷酸酶全长基因，命名为hcalp1、hcalp3（GenBank登录号分别为MH796758、MH796759）。hcalp1开放阅读框为1596bp，编码507个氨基酸，预测蛋白分子量和等电点分别为60.413kDa和5.83;hcalp3开放阅读框为1557bp，编码518个氨基酸，预测蛋白分子量和等电点分别为56.647kDa和5.07。构建原核重组表达载体pET30a-hcalp1、pET30a-hcalp3，IPTG诱导HcALPs重组蛋白表达，蛋白大小约为70kDa。
2.实时荧光定量PCR分析hcalps的基因不同发育时期和组织表达水平，结果表明，hcalp1和hcalp3在四龄幼虫表达量最高;在四龄2d幼虫的不同组织中，hcalp1在中肠上的表达量最高，其次为后肠，而hcalp3在四龄幼虫中肠和马氏管表达量较高。
3.Bt Cry1Ab35、Cry1Ac和Cry9Ea10原毒素分别经胰蛋白酶消化后，与HcALPs重组蛋白进行体外配体杂交试验，HcALP1重组蛋白与Bt Cry1Ab35、Cry1Ac和Cry9Ea10均能特异结合，而HcALP3重组蛋白仅与Bt Cry1Ab35特异结合。
4.对美国白蛾不同龄期幼虫进行了Bt Cry1Ab35、Cry1Ac和Cry9Ea10的生物测定，三种蛋白对美国白蛾三龄2d幼虫杀虫活性LC50值分别为49.75μg/mL、22.33μg/mL和78.51μg/mL;对美国白蛾四龄2d幼虫则LC50值分别为114.41μg/mL、123.32μg/mL和272.81μg/mL。RNA干扰技术进行hcalps沉默，qRT-PCR检测沉默效率，结果显示hcalp1、hcalp3表达水平分别降低了58.04％、75.32％。对美国白蛾幼虫进行Bt蛋白的敏感性试验，发现注射美国白蛾幼虫dsRNA-hcalp1后显著降低其对Bt Cry1Ab35、Cry1Ac和Cry9Ea10蛋白的敏感性(p＜0.05)，而注射美国白蛾幼虫dsRNA-hcalp3后未显著降低其对Bt Cry蛋白的敏感性。
通过对美国白蛾体外和体内实验，表明HcALP1蛋白是Bt Cry1Ab35、Cry1Ac和Cry9Ea10在中肠上的功能受体;HcALP3蛋白是否为Bt Cry蛋白在中肠上的功能受体仍需进一步验证。本实验结果为明确不同类型的Bt蛋白对美国白蛾的作用机理提供基础资料。
1.根据美国白蛾中肠转录组数据获得碱性磷酸酶序列，设计特异引物，PCR扩增得到美国白蛾中肠碱性磷酸酶全长基因，命名为hcalp1、hcalp3（GenBank登录号分别为MH796758、MH796759）。hcalp1开放阅读框为1596bp，编码507个氨基酸，预测蛋白分子量和等电点分别为60.413kDa和5.83;hcalp3开放阅读框为1557bp，编码518个氨基酸，预测蛋白分子量和等电点分别为56.647kDa和5.07。构建原核重组表达载体pET30a-hcalp1、pET30a-hcalp3，IPTG诱导HcALPs重组蛋白表达，蛋白大小约为70kDa。
2.实时荧光定量PCR分析hcalps的基因不同发育时期和组织表达水平，结果表明，hcalp1和hcalp3在四龄幼虫表达量最高;在四龄2d幼虫的不同组织中，hcalp1在中肠上的表达量最高，其次为后肠，而hcalp3在四龄幼虫中肠和马氏管表达量较高。
3.Bt Cry1Ab35、Cry1Ac和Cry9Ea10原毒素分别经胰蛋白酶消化后，与HcALPs重组蛋白进行体外配体杂交试验，HcALP1重组蛋白与Bt Cry1Ab35、Cry1Ac和Cry9Ea10均能特异结合，而HcALP3重组蛋白仅与Bt Cry1Ab35特异结合。
4.对美国白蛾不同龄期幼虫进行了Bt Cry1Ab35、Cry1Ac和Cry9Ea10的生物测定，三种蛋白对美国白蛾三龄2d幼虫杀虫活性LC50值分别为49.75μg/mL、22.33μg/mL和78.51μg/mL;对美国白蛾四龄2d幼虫则LC50值分别为114.41μg/mL、123.32μg/mL和272.81μg/mL。RNA干扰技术进行hcalps沉默，qRT-PCR检测沉默效率，结果显示hcalp1、hcalp3表达水平分别降低了58.04％、75.32％。对美国白蛾幼虫进行Bt蛋白的敏感性试验，发现注射美国白蛾幼虫dsRNA-hcalp1后显著降低其对Bt Cry1Ab35、Cry1Ac和Cry9Ea10蛋白的敏感性(p＜0.05)，而注射美国白蛾幼虫dsRNA-hcalp3后未显著降低其对Bt Cry蛋白的敏感性。
通过对美国白蛾体外和体内实验，表明HcALP1蛋白是Bt Cry1Ab35、Cry1Ac和Cry9Ea10在中肠上的功能受体;HcALP3蛋白是否为Bt Cry蛋白在中肠上的功能受体仍需进一步验证。本实验结果为明确不同类型的Bt蛋白对美国白蛾的作用机理提供基础资料。