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乳酸菌是在食品、医药等领域广泛应用的微生物,用乳酸菌构建以非抗生素抗性为选择标记的食品级载体的研究越来越为人们所关注.
目的：
构建含小鼠铜锌超氧化物歧化酶基因的食品级表达载体pLEB590-mCu,Zn-SOD并在乳酸乳球菌MG1614中表达,同时构建红霉素选择标记的表达载体pMG36e-mCu,Zn-SOD并在MG1363中表达,探索今后研究中pLEB590代替pMG36e的可行性。克隆含PnisA乳链菌肽前体基因,为今后构建以nisI为选择标记的NICE表达系统奠定基础。
方法：
1.根据GeneBank中的小鼠铜锌超氧化物酶mRNA设计引物,提取小鼠肝脏组织RNA后通过反转录合成cDNA然后克隆至T载体并测序。
2.在成功克隆mCuZnSOD的引物基础上,添加限制性酶切位点重新设计引物定向克隆至pLEB590和pMG36e,PCR和双酶切鉴定重组质粒,并将重组质粒pLEB590-mCuZnSOD和pMG36e-mCuZnSOD分别电转化至乳酸乳球菌MG1614和MG1363,用PCR和双酶切鉴定重组菌。
3.过夜培养重组菌后,加变溶菌素并超声破碎菌体提取蛋白,结合SDS-PAGE、免疫印迹和SOD酶活测定的方法分析目的基因的表达产物。
4.提取产乳链菌肽的乳酸乳球菌的基因组,设计引物克隆乳链菌肽前体基因,将其克隆至T载体。测序后判断乳链菌肽的类型,并分析启动子区域位点。
结果
1.构建克隆载体pUC19-mCuZnSOD。
2.构建表达载体pMG36e-mCuZnSOD和pLEB590-mCuZnSOD,并分别电转化至乳酸乳球菌MG1363和MG1614。
3.westernblot结果显示mCuZnSOD在MG1363和MG1614获得表达,SOD酶活显示MG1363-mCuZnSOD的SOD酶活是其对照菌株的4.9倍,而MG1614-mCuZnSOD的SOD酶活是其对照菌株的4.3倍。
4.成功克隆产乳链菌肽菌的乳菌肽前体基因至T载体,经测序后确定为A型并分析启动子区域结构和所在位点。