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金针菇是一种广泛栽培的食药用蘑菇，具有诱人的味道和丰富的营养价值。多糖是金针菇中的主要活性成分之一，具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节等多种生物活性。已有研究发现金针菇多糖(FVP)可刺激巨噬细胞增殖和吞噬作用，也可与RAW264.7细胞表面TLR4结合，从而活化巨噬细胞，激活MAPK/NF-κB信号通路释放免疫因子调节免疫。有研究表明TLR4-PI3K-Rac1通路可影响细胞骨架重排，调节RAW264.7细胞吞噬功能。但关于FVP与RAW264.7细胞吞噬功能间关系尚不明确，本实验从金针菇中获得金针菇多糖FVP-C及FVP-1，并探究其对RAW264.7细胞吞噬作用及吞噬相关通路TLR4-PI3K-Rac1的影响。
本研究包括FVP的分离纯化及对RAW264.7细胞的吞噬作用的影响两部分。研究方法及结果如下：
1、通过水提醇沉、Sevag法除蛋白后获得金针菇粗多糖FVP-C，将FVP-C通过DEAE-SepharoseFastFlow离子交换柱层析和SephadexG-100分子筛柱层析进一步纯化后获得金针菇纯化多糖FVP-1。化学组成分析可知FVP-C总糖、还原糖、糖醛酸、硫酸基和蛋白质含量分别为61.61%、5.64%、4.18%、23.72%和2.36%。红外光谱分析表明，FVP-C为呋喃糖苷，FVP-1为吡喃糖苷。高效凝胶渗透色谱(HPGPC)检测FVP-1平均分子量为54855.41Da。单糖组成分析可知FVP-1由甘露糖(42.28%)、鼠李糖(3.04%)、葡萄糖(41.10%)、半乳糖(7.41%)、岩藻糖(6.17%)组成。紫外光谱分析可知FVP-1中不存在蛋白质。
2、使用MTT法检测FVP-C及FVP-1对RAW264.7细胞活性的影响。结果表明FVP-C及FVP-1浓度为25、50、100、200μg/mL时对RAW264.7细胞无毒性，并且在25μg/mL时具有最强增殖活性。中性红结果表明，FVP-C浓度为25-100μg/mL时，能促进巨噬细胞吞噬活性，200μg/mL时吞噬活性与对照组无差异，并且在50μg/mL时具有最大吞噬活性。而FVP-1在25-200μg/mL范围内以剂量依赖方式促进RAW264.7细胞吞噬作用。选取50μg/mLFVP-C及200μg/mL的FVP-1通过吞菌实验和流式细胞仪进一步探究其对RAW264.7细胞吞噬作用的影响。结果表明，FVP-C及FVP-1能够促进RAW264.7细胞对沙门氏菌和FITC-dextran的吞噬作用。
3、流式细胞仪检测结果表明，TLR4抑制剂和PI3K抑制剂可以降低FVP-C及FVP-1诱导的RAW264.7细胞吞噬作用。qPCR检测25-100μg/mL浓度范围的FVP-C及25-200μg/mL浓度范围的FVP-1对TLR4、PI3K、Rac1mRNA表达的影响，结果表明，FVP-C以浓度依赖方式促进TLR4mRNA的表达。FVP-C对PI3K及Rac1mRNA的表达均呈先上升后降低的趋势，并在50μg/mL时达到最大值。FVP-1均以浓度依赖方式促进TLR4、PI3K、Rac1mRNA的表达。ELISA试剂盒检测FVP-C及FVP-1对TLR4、PI3K、Rac1、p-Rac1蛋白表达的影响，结果表明，FVP-C显著上调TLR4、PI3K、Rac1及p-Rac1蛋白表达，并且在50μg/mL时达到最大值。FVP-1对TLR4、PI3K、Rac1蛋白表达的影响呈一定的上升趋势，但对p-Rac1蛋白表达的影响无明显差异。
结论：本研究从金针菇中分离出两种不同组分多糖FVP-C和FVP-1。结构分析表明，FVP-C为呋喃型糖，其蛋白质含量为2.16%，糖醛酸含量为4.18%。FVP-1为β-D葡萄吡喃糖，由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖组成，在FVP-1中并未发现蛋白质及糖醛酸的存在。FVP-C及FVP-1促进RAW264.7细胞的增殖活性及吞噬作用。TLR4、PI3K参与FVP-C及FVP-1诱导的巨噬细胞吞噬作用。
本实验对FVP进行分离纯化，并初步探究FVP对RAW264.7细胞吞噬作用及吞噬相关通路的影响，为金针菇多糖的免疫调节活性提供一定的实验基础。
本研究包括FVP的分离纯化及对RAW264.7细胞的吞噬作用的影响两部分。研究方法及结果如下：
1、通过水提醇沉、Sevag法除蛋白后获得金针菇粗多糖FVP-C，将FVP-C通过DEAE-SepharoseFastFlow离子交换柱层析和SephadexG-100分子筛柱层析进一步纯化后获得金针菇纯化多糖FVP-1。化学组成分析可知FVP-C总糖、还原糖、糖醛酸、硫酸基和蛋白质含量分别为61.61%、5.64%、4.18%、23.72%和2.36%。红外光谱分析表明，FVP-C为呋喃糖苷，FVP-1为吡喃糖苷。高效凝胶渗透色谱(HPGPC)检测FVP-1平均分子量为54855.41Da。单糖组成分析可知FVP-1由甘露糖(42.28%)、鼠李糖(3.04%)、葡萄糖(41.10%)、半乳糖(7.41%)、岩藻糖(6.17%)组成。紫外光谱分析可知FVP-1中不存在蛋白质。
2、使用MTT法检测FVP-C及FVP-1对RAW264.7细胞活性的影响。结果表明FVP-C及FVP-1浓度为25、50、100、200μg/mL时对RAW264.7细胞无毒性，并且在25μg/mL时具有最强增殖活性。中性红结果表明，FVP-C浓度为25-100μg/mL时，能促进巨噬细胞吞噬活性，200μg/mL时吞噬活性与对照组无差异，并且在50μg/mL时具有最大吞噬活性。而FVP-1在25-200μg/mL范围内以剂量依赖方式促进RAW264.7细胞吞噬作用。选取50μg/mLFVP-C及200μg/mL的FVP-1通过吞菌实验和流式细胞仪进一步探究其对RAW264.7细胞吞噬作用的影响。结果表明，FVP-C及FVP-1能够促进RAW264.7细胞对沙门氏菌和FITC-dextran的吞噬作用。
3、流式细胞仪检测结果表明，TLR4抑制剂和PI3K抑制剂可以降低FVP-C及FVP-1诱导的RAW264.7细胞吞噬作用。qPCR检测25-100μg/mL浓度范围的FVP-C及25-200μg/mL浓度范围的FVP-1对TLR4、PI3K、Rac1mRNA表达的影响，结果表明，FVP-C以浓度依赖方式促进TLR4mRNA的表达。FVP-C对PI3K及Rac1mRNA的表达均呈先上升后降低的趋势，并在50μg/mL时达到最大值。FVP-1均以浓度依赖方式促进TLR4、PI3K、Rac1mRNA的表达。ELISA试剂盒检测FVP-C及FVP-1对TLR4、PI3K、Rac1、p-Rac1蛋白表达的影响，结果表明，FVP-C显著上调TLR4、PI3K、Rac1及p-Rac1蛋白表达，并且在50μg/mL时达到最大值。FVP-1对TLR4、PI3K、Rac1蛋白表达的影响呈一定的上升趋势，但对p-Rac1蛋白表达的影响无明显差异。
结论：本研究从金针菇中分离出两种不同组分多糖FVP-C和FVP-1。结构分析表明，FVP-C为呋喃型糖，其蛋白质含量为2.16%，糖醛酸含量为4.18%。FVP-1为β-D葡萄吡喃糖，由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖组成，在FVP-1中并未发现蛋白质及糖醛酸的存在。FVP-C及FVP-1促进RAW264.7细胞的增殖活性及吞噬作用。TLR4、PI3K参与FVP-C及FVP-1诱导的巨噬细胞吞噬作用。
本实验对FVP进行分离纯化，并初步探究FVP对RAW264.7细胞吞噬作用及吞噬相关通路的影响，为金针菇多糖的免疫调节活性提供一定的实验基础。