论文部分内容阅读
目的加强血源及血液制品的筛查和监控是防止感染血液传播性疾病的重要手段。目前,在输血传播性疾病早期筛查技术方面,最先进、方便的方法是ELISA酶联免疫诊断技术,其主要缺陷是不能同步检测,测试时间长、耗费试剂多。而芯片技术由于具有高通量、可平行检测、用时少、节省试剂、易于实现自动化等优点,已日益引起医学检验领域的关注。本文将乙型肝炎病毒(HBV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、梅毒螺旋体(TP)集成在一起,研制了可供大医院实验室使用的荧光免疫芯片和供社区、急救现场、床旁检验、小型门诊、尤其是野战和部队基层需要的金标免疫芯片,为蛋白芯片开发适用、扩大范围进行了初步研究。方法:1.对封闭液加以选择,寻找抗原抗体结合率与信号强度的最佳方案。2.对关键的检测条件进行统一,以满足多种病原体同步检测的需要。将反应体系的终体积定为25μl,反应温度为37℃,反应时间为30min,检测HBV、HIV、HCV和TP四种标准品,观察检测范围、灵敏度、重复性。3.取其它血液传播性疾病呈阳性的血清32份进行检测,观察蛋白芯片的特异性。4.用荧光蛋白微阵列和金标蛋白微阵列分别检测国家参比品并与ELISA检测试剂盒的结果比较,观察两种检测方法的结果有无统计学差异。主要结果:1.方法学建立蛋白芯片的制备及实验条件的优化:选择2%BSA的PBS为实验的封闭液;荧光法:HBV检测范围:3ng/ml～150ng/ml Y=11.972X+179.502HIV检测范围:1.5NCU/ml～100NCU/ml Y=20.224X+241.733HCV检测范围:1.5NCU/ml～170NCU/ml Y=11.171X+478.018TP检测范围:1.5NCU/m～120NCU/ml Y=13.335X+200.358金标法HBV检测范围:5ng/ml～150ng/ml Y=3.841X+150.989HIV检测范围:2NCU/ml～100NCU/ml Y=6.026X+99.753HCV检测范围:2NCU/ml～170NCU/ml Y=4.058X+99.873TP检测范围:2NCU/ml～120NCU/ml Y=4.819X+122.45荧光蛋白微阵列检测200例健康人血清样本确定了Cutoff值:HBV:4.25;HIV:2.08;HCV:2.41;TP:1.88。取HBv(3ng/ml)、HIV(1.5NCU/ml)、HCV(1NCU/ml)和TP(1NCU/ml)的标准品,荧光微阵列批内变异系数分别为2.8%、3.6%、6.0%、4.7%,天间变异系数分别为8.3%、6.8%、8.3%、5.6%。取HBv(5ng/ml)、HIV(2NCU/ml)、HCV(2NCU/ml)和TP(2NCU/ml)的标准品,金标微阵列批内变异系数分别为2.8%、4.4%、3.9%、4.5%,天间变异系数分别为4.9%、5.0%、4.8%、5.7%。2.方法学比较ELISA试剂盒检测HBV、HIV、HCV和TP四种国家参比品符合率分别为98.75%、97.5%、98.75%、100%。荧光蛋白微阵列符合率分别为93.75%、95%、95%、96.67%。用统计学的配对计数资料检验得出:χ~2=0.5,P=0.125,说明两种方法检测结果无统计学差异。ELISA试剂盒检测HBV、HIV、HCV和TP四种国家参比品符合率分别为96.25%、95%、97.5%、100%。金标蛋白微阵列符合率分别为95%、92.5%、95%、93%。用统计学的配对计数资料检验得出:χ~2=1.33,P=0.171,说明两种方法检测结果无统计学差异。3.临床验证取其它血液传播性疾病呈阳性的血清合计32份进行检测,结果均不能在两种蛋白微阵列中检出,证实了荧光蛋白微阵列和金标蛋白微阵列的特异性。用蛋白微阵列检测临床阴性标本160份,结果:荧光蛋白微阵列假阳性11份,金标蛋白微阵列假阳性12份。结论:1.在醛基玻片上成功固化了蛋白质抗原和抗体,通过封闭等处理,消除了背景的干扰,构建了金标蛋白微阵列和荧光蛋白微阵列芯片,为荧光和可视化检测奠定了基础。2.构建的荧光蛋白芯片是一种特异性较好、速度快、操作简便、灵敏度高的检测方法,能够满足医院临床实验室快速筛检的需要。3.运用纳米金标记技术和银染技术实现了芯片可视化,能满足现场筛选、急救现场、床旁检验、小型门诊、野战和部队基层等的需要。4.优化了多指标同步检测的实验条件,为研制其它病原体快速检测蛋白芯片奠定了技术基础。