【摘 要】
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RNA上存在着多种化学修饰,如m6A（N6-methyladenosine）、m6Am（N6,2’-Odimethyladenosine）、m5C（5-methylcytosine）、m1A（N1-methyladenosine）,这些修饰普遍存在于转运RNA（tRNA）、核糖体RNA（rRNA）以及信使RNA（mRNA）上。腺嘌呤甲基化修饰（N6-methyladenosine）是真核生物mRN
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RNA上存在着多种化学修饰,如m6A（N6-methyladenosine）、m6Am（N6,2’-Odimethyladenosine）、m5C（5-methylcytosine）、m1A（N1-methyladenosine）,这些修饰普遍存在于转运RNA（tRNA）、核糖体RNA（rRNA）以及信使RNA（mRNA）上。腺嘌呤甲基化修饰（N6-methyladenosine）是真核生物mRNA上最广泛的一种修饰类型。众所周知,mRNA是连接DNA和蛋白质的枢纽,而mRNA上的修饰则会直接影响其功能和稳定性,因此m6A对于基因组遗传信息的传递和基因功能的发挥都起着至关重要的作用。目前对于水稻中m6A修饰的结合蛋白及其功能还不清楚,本研究利用生物信息学、分子生物学和生物化学的研究方法,对水稻中m6A修饰的结合蛋白进行鉴定和初步功能分析。主要研究结果如下:1.哺乳动物和拟南芥中已报道的m6A结合蛋白主要是一类含有YTH保守结构域的蛋白。据此,我们通过BLAST发现水稻基因组中共有12个含有保守YTH结构域的蛋白编码基因,分别命名为OsECT1～OsECT12。利用Pymol软件对水稻YTH家族蛋白结构进行建模分析,测量关键氨基酸与m6A的空间距离,预测结果表明OsECT1、OsECT2、OsECT3、OsECT10、OsECT12具有较高的m6A结合活性。2.通过RiceXPro网站上的数据分析发现YTH家族中OsECT1、OsECT2、OsECT3在水稻不同组织中的表达量均较高。进一步对OsECT1、OsECT2、OsECT3在水稻不同组织中的表达模式分析,结果表明OsECT1在剑叶中表达量最高,在花药表达最低;OsECT2在发芽10 d的根和抽穗期剑叶表达最高,在花药表达最低;OsECT3在10 d的根中表达最高,在花药中表达最低。水稻原生质体亚细胞定位表明OsECT1、OsECT2和OsECT3均定位于细胞质中。3.通过遗传转化方法创建了OsECT1和OsECT2超量表达材料和OsECT1、OsECT2、OsECT3的CRISPR/Cas9敲除突变体材料。通过表型分析发现osect1-crispr敲除突变体没有明显的发育表型;osect2-crispr的敲除突变体相对于野生型株高变矮;osect3-crispr相比于野生型种子萌发率下降、苗期生长迟缓、成熟期植株矮小以及分蘖数减少。对OsECT1和OsECT2的T-DNA插入突变体进行鉴定和表型分析,发现osect2种子粒长增加,粒宽变窄。4.对野生型幼苗分别进行42℃高温、4℃低温、180m M NaCl和20%PEG6000处理,检测OsECT1、OsECT2、OsECT3的表达水平对不同胁迫的响应。结果表明OsECT1和OsECT3在42℃高温、180m M NaCl和20%PEG6000处理下表达量上升,在4℃低温处理下表达受到抑制;OsECT2在180m M NaCl和20%PEG6000处理下表达量上升,4℃低温处理下表达受到抑制。osect3-crispr突变体进行180m M NaCl处理,结果表明其对盐胁迫的敏感性相比野生型明显增加。5.通过酵母双杂交实验分别对OsECT1、OsECT2和OsECT3进行互作蛋白的筛选。结果表明组蛋白H3第27位赖氨酸（H3K27me3）甲基转移酶SDG718和丝氨酸/苏氨酸磷酸酶OsPP2Ac与OsECT1互作。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶G6PD702和丝氨酸/苏氨酸磷酸酶OsPP2Ac与OsECT2互作。KNOX转录因子结合蛋白KNB36和丝氨酸/苏氨酸磷酸酶OsPP2Ac与OsECT3互作。
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