【摘 要】
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CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）-Cas（CRISPR-associated）系统是原核生物中用于抵御外源入侵遗传因子的适应性免疫系统。狄氏副拟杆菌（Parabacteroides distasonis,P.distasonis）是肠道微生物的18个核心种之一,在缓解肥胖和代谢异常方面具有重要作用,具
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CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）-Cas（CRISPR-associated）系统是原核生物中用于抵御外源入侵遗传因子的适应性免疫系统。狄氏副拟杆菌（Parabacteroides distasonis,P.distasonis）是肠道微生物的18个核心种之一,在缓解肥胖和代谢异常方面具有重要作用,具有重要应用价值,但其CRISPR-Cas系统缺少系统的研究。本研究旨在运用生物信息学方法分析狄氏副拟杆菌中CRISPR-Cas系统的分布情况及特征,在分析过程中发现的一个可能与Ⅲ-A亚型系统免疫功能相关的VirE蛋白,实验验证VirE蛋白是否与Cas蛋白互作,为进一步研究并应用狄氏副拟杆菌中CRISPR-Cas系提供基础。本研究结果如下:从NCBI上下载94株狄氏副拟杆菌菌株的基因组信息后,通过CRISPR Finder网站确定菌株中存在的CRISPR-Cas系统类型以及CRISPR簇（CRISPR array）,发现80.9%的菌株具有CRISPR-Cas系统,包括Ⅰ-C、Ⅱ-C、Ⅲ-A、Ⅴ-A和Ⅵ-B亚型,其中最普遍的是Ⅰ-C、Ⅱ-C亚型,而且CRISPR-Cas系统与原噬菌体、Argonaute蛋白的存在具有显著的相关性。对所有检索到的CRISPR-Cas系统的操纵子结构分析发现,Ⅰ-C亚型系统的操纵子结构主要包括两种,其中大多数菌株为典型的Ⅰ型系统的结构,另外16个菌株中在cas3基因前有一个预测的cas3基因,命名为cas3p（pseudocas3）;所有Ⅱ-C亚型操纵子与典型结构一致;Ⅲ-A亚型中,在cas1和cas2基因中间有一个编码未知蛋白的基因virE;Ⅴ-A亚型操纵子与典型结构类似;Ⅵ-B亚型系统和大多数Ⅵ型CRISPR-Cas系统操纵子结构相同,缺少适应模块（adaptation module）。对Cas3蛋白序列进行多序列对比并构建进化树,发现Cas3蛋白的进化树形成了 Cas3 和 Cas3p 两个分枝。用 CRISPRtionary 网站分析 CRISPR array 中 spacer（间隔序列）的分布,发现狄氏副拟杆菌中spacer丢失现象严重,说明CRISPR array处在动态的变化中。用CRISPRtarget网站预测spacer对应的protospacer（前间隔序列）,结果显示狄氏副拟杆菌中与protospacer对应的spacer 比例明显高于古菌和细菌的平均值;将protospacer侧翼序列提交到WebLogo网站中,预测不同亚型系统的PAM序列,其中Ⅰ-C、Ⅱ-C和V-A的PAM序列较为保守。用RNAfold软件预测repeat的二级结构,其中Ⅰ-C、Ⅲ-A、Ⅴ-A亚型系统能形成较稳定的茎环结构,而Ⅱ-C、Ⅵ-B亚型仅能形成不稳定的茎环结构。用VirE蛋白序列进行PSI-BLAST,发现与之相似度高的同源蛋白编码基因均位于cas1、cas2基因之间,以此推测VirE蛋白与CRISPR-Cas系统功能相关。在大肠杆菌中共表达Cas1、Cas2和VirE 3个蛋白,经过亲和层析和凝胶过滤层析分离纯化后,利用SDS-PAGE凝胶电泳证实3个蛋白在大肠杆菌内可以发生结合。综上所述,狄氏副拟杆菌的CRISPR-Cas系统发生率明显高于所有细菌的平均值,而且处于有活性的状态。本研究过程中发现的的未知蛋白VirE可以在体内和Cas蛋白结合,推测VirE蛋白参与Ⅲ-A亚型系统的适应过程。
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