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目的:本实验主要研究小鼠孤雌激活、体外受精与核移植早期胚胎发育过程中,γ-微管蛋白的动态变化及作用。
方法:采用免疫荧光化学与激光共聚焦显微技术,检测卵母细胞在孤雌激活(parthenogenetic,PA)、体外受精(in vitrofertilized,IVF)和核移植(nuclear transfer,NT)过程中γ-微管蛋白和核的动态变化,以分析γ-微管蛋白在减数分裂、有丝分裂过程中的作用及其对体细胞核移植重构胚的影响。同时,用Western Blot对孤雌激活过程中γ-微管蛋白的表达进行定量分析。
结果:卵母细胞孤雌激活率高于体外受精率,但卵裂率和囊胚发育率差别不显著。孤雌激活过程中γ-微管蛋白的量保持不变。γ-微管蛋白主要定位于中期纺锤体两极和后、末期分开的染色单体之间。孤雌激活和核移植后两类原核周围有微弱的点状γ-微管蛋白表达;但体外受精后仅在雌原核附近可见;早期孤雌胚有丝分裂间期无定形的γ-微管蛋白均匀分布于核:前中期向两极移动,遍布于整个纺锤体区。核移植重构胚在活化前就发生染色体提前凝集(premature chromosome condensation,PCC)形成类似中期纺锤体,但染色体分布不对称,γ-微管蛋白浓缩于两极或沿着整个纺锤体微管分布;偶见一个γ-微管蛋白聚集点,染色体以聚集点为中心里放射状排列。原核期核移植重构胚胞质内出现多个类原核,含有多个核仁。第二次减数分裂中期(second metaphase,M II)卵母细胞去核后γ-微管蛋白明显减少,免疫荧光几乎检测不到,激活后又重新出现,主要分布于皮层,但没有新的纺锤体形成。
结论:孤雌激活过程中γ-微管蛋白的量保持不变。γ-微管蛋白具有促微管负极形成和稳定微管的功能,从而促进纺锤体的形成:分裂后期和末期γ-微管蛋白的重新分布是由纺锤体牵引同源染色体分离所诱导的。供体细胞内的γ-微管蛋白促进核移植重构胚纺锤体的形成;核移植重构胚易被提前激活,染色体随机分离,从而形成多个类原核。