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软骨组织工程（CTE）是用于再生或修复由于疾病、创伤而受损的软骨组织的技术，它的基本原理是在体外培养、扩增软骨种子细胞于生物相容性和降解性良好的支架材料上，并在多种信号因子的调节作用下，经过一定周期形成组织工程化软骨的过程。水凝胶（Hydrogel）是广泛用于软骨组织工程的一类支架，含水量高且多孔，可支持营养物质和废物的运输以及传递机械载荷，同时可以将软骨细胞均匀地悬浮在三维环境中，保留其原有的细胞形态。壳聚糖（CTS）与软骨细胞外基质成分糖胺聚糖的结构类似，常被用于制备CTE水凝胶支架，然而壳聚糖水凝胶的机械性能较差，无论在力学性能还是结构特点上均无法满足软骨再生的应用要求。因此，如何增强壳聚糖水凝胶的力学性能已成为软骨组织工程领域的一个研究热点。本课题提出利用天然植物纤维素纤维和纤维素纳米晶（CNCs）改善壳聚糖水凝胶的力学性能并提高其促软骨形成能力的可能性。
第一部分，制备了玉米壳来源的纤维素纤维增强的柠檬酸改性壳聚糖（CHFs/CC）复合水凝胶，并对其进行了性能表征与生物学评价。首先，通过浸酸、碱煮等处理制备玉米壳纤维（CHFs），发现经过煮练Ⅰ60min、煮练Ⅱ60min，并重复碱煮一次的工艺条件可获得形貌完整且纯净的CHFs，纤维直径（宽度）约为23.4±5.9μm，结晶度为48.9%。然后，在课题组原有的研究基础上，配制柠檬酸改性的壳聚糖水凝胶溶液（CC），与不同比例的CHFs复合，通过冷冻-解冻法制备CC、CHFs/CC(1∶1)及CHFs/CC(2∶1)三组复合水凝胶。FTIR结果显示CHFs/CC复合水凝胶在波数2876cm-1处出现了新峰，并且在波数为3330cm-1处峰强度增加，说明CTS和CHFs分子间存在氢键作用；扫描电镜观察到水凝胶的孔径随着CHFs的引入而减小，孔隙率、溶胀性能也表现出相同的趋势。CHFs的引入显著改善了CC水凝胶的力学性能，例如：湿态下压缩至水凝胶自身形变的60%时，CC水凝胶的抗压强度和杨氏模量分别为3.97±0.24KPa和9.08±0.65KPa，而CHFs/CC复合水凝胶的抗压强度和杨氏模量则增加了1-2倍；循环压缩测试发现，第一次压缩循环时CC、CHFs/CC(1∶1)和CHFs/CC(2∶1)复合水凝胶的能量损耗分别达到了54.50%、53.47%和52.22%，第十次压缩循环时能量损耗则分别下降到了29.45%、24.28%、24.02%。此外，降解实验表明CHFs能够提高复合水凝胶的结构稳定性。细胞增殖和活/死细胞染色结果均表明该CHFs/CC复合水凝胶对软骨细胞有良好的细胞相容性；Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫荧光染色和总胶原、糖胺聚糖定量结果显示，CHFs/CC复合水凝胶能够支持软骨细胞合成细胞外基质。
第二部分，制备了CNCs/CC复合水凝胶并对其进行了性能表征与生物学评价。由木屑纤维进一步酸水解获得了纤维素纳米晶，TEM下观察细丝状的CNCs的长度为371.5±77.2nm、直径为17.8±6.1nm，XRD检测其结晶度为64.4%，较CHFs有所提高。随后，混合不同比例的CNCs和CC凝胶溶液，冷冻-解冻后制备了CC、CNCs/CC(1∶9)、CNCs/CC(1∶5)和CNCs/CC(1∶2)四组复合水凝胶。与CHFs/CC复合水凝胶类似，FTIR结果显示CTS和CNCs之间形成了氢键。水凝胶截面形貌SEM观察结果表明CNCs对水凝胶的孔径无太大影响，均在100μm以上；孔隙率测试显示CC水凝胶的孔隙率最大，约为87.2%，CNCs/CC(1∶9)复合水凝胶次之，约为84.0%，CNCs/CC(1∶2)复合水凝胶的孔隙率最小，约为78.5%；各组水凝胶的平衡溶胀率都在3000%以上，均具有较好的吸水性能。压缩力学测试结果显示，CNCs的掺入显著地提升了水凝胶的压缩力学性能。CNCs/CC(1∶9)复合水凝胶在湿态下的抗压强度和杨氏模量约为CC水凝胶的3倍；另外，CNCs的引入也增强了水凝胶的韧性。细胞增殖和活/死细胞染色均显示了CNCs/CC复合水凝胶良好的细胞相容性，同时它也能在体外维持软骨细胞接近于天然软骨中的细胞形态；生化组成分析结果显示，添加适量的CNCs可以促软骨细胞分泌胶原和糖胺聚糖。
综上，本课题从纤维素纤维和纳米晶增强水凝胶力学性能并仿生软骨的超结构出发，制备了两种新型的壳聚糖基水凝胶支架，证明了从天然植物中获取的纤维素纤维或纳米晶与CC复合时可以获得极高机械强度的复合水凝胶，有作为软骨组织工程支架的应用潜力。
第一部分，制备了玉米壳来源的纤维素纤维增强的柠檬酸改性壳聚糖（CHFs/CC）复合水凝胶，并对其进行了性能表征与生物学评价。首先，通过浸酸、碱煮等处理制备玉米壳纤维（CHFs），发现经过煮练Ⅰ60min、煮练Ⅱ60min，并重复碱煮一次的工艺条件可获得形貌完整且纯净的CHFs，纤维直径（宽度）约为23.4±5.9μm，结晶度为48.9%。然后，在课题组原有的研究基础上，配制柠檬酸改性的壳聚糖水凝胶溶液（CC），与不同比例的CHFs复合，通过冷冻-解冻法制备CC、CHFs/CC(1∶1)及CHFs/CC(2∶1)三组复合水凝胶。FTIR结果显示CHFs/CC复合水凝胶在波数2876cm-1处出现了新峰，并且在波数为3330cm-1处峰强度增加，说明CTS和CHFs分子间存在氢键作用；扫描电镜观察到水凝胶的孔径随着CHFs的引入而减小，孔隙率、溶胀性能也表现出相同的趋势。CHFs的引入显著改善了CC水凝胶的力学性能，例如：湿态下压缩至水凝胶自身形变的60%时，CC水凝胶的抗压强度和杨氏模量分别为3.97±0.24KPa和9.08±0.65KPa，而CHFs/CC复合水凝胶的抗压强度和杨氏模量则增加了1-2倍；循环压缩测试发现，第一次压缩循环时CC、CHFs/CC(1∶1)和CHFs/CC(2∶1)复合水凝胶的能量损耗分别达到了54.50%、53.47%和52.22%，第十次压缩循环时能量损耗则分别下降到了29.45%、24.28%、24.02%。此外，降解实验表明CHFs能够提高复合水凝胶的结构稳定性。细胞增殖和活/死细胞染色结果均表明该CHFs/CC复合水凝胶对软骨细胞有良好的细胞相容性；Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫荧光染色和总胶原、糖胺聚糖定量结果显示，CHFs/CC复合水凝胶能够支持软骨细胞合成细胞外基质。
第二部分，制备了CNCs/CC复合水凝胶并对其进行了性能表征与生物学评价。由木屑纤维进一步酸水解获得了纤维素纳米晶，TEM下观察细丝状的CNCs的长度为371.5±77.2nm、直径为17.8±6.1nm，XRD检测其结晶度为64.4%，较CHFs有所提高。随后，混合不同比例的CNCs和CC凝胶溶液，冷冻-解冻后制备了CC、CNCs/CC(1∶9)、CNCs/CC(1∶5)和CNCs/CC(1∶2)四组复合水凝胶。与CHFs/CC复合水凝胶类似，FTIR结果显示CTS和CNCs之间形成了氢键。水凝胶截面形貌SEM观察结果表明CNCs对水凝胶的孔径无太大影响，均在100μm以上；孔隙率测试显示CC水凝胶的孔隙率最大，约为87.2%，CNCs/CC(1∶9)复合水凝胶次之，约为84.0%，CNCs/CC(1∶2)复合水凝胶的孔隙率最小，约为78.5%；各组水凝胶的平衡溶胀率都在3000%以上，均具有较好的吸水性能。压缩力学测试结果显示，CNCs的掺入显著地提升了水凝胶的压缩力学性能。CNCs/CC(1∶9)复合水凝胶在湿态下的抗压强度和杨氏模量约为CC水凝胶的3倍；另外，CNCs的引入也增强了水凝胶的韧性。细胞增殖和活/死细胞染色均显示了CNCs/CC复合水凝胶良好的细胞相容性，同时它也能在体外维持软骨细胞接近于天然软骨中的细胞形态；生化组成分析结果显示，添加适量的CNCs可以促软骨细胞分泌胶原和糖胺聚糖。
综上，本课题从纤维素纤维和纳米晶增强水凝胶力学性能并仿生软骨的超结构出发，制备了两种新型的壳聚糖基水凝胶支架，证明了从天然植物中获取的纤维素纤维或纳米晶与CC复合时可以获得极高机械强度的复合水凝胶，有作为软骨组织工程支架的应用潜力。