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目的：性发育是哺乳动物个体性成熟并获得生殖能力的过程，下丘脑GnRH神经元持续性脉冲式释放GnRH是启动性发育的标志事件，其中GnRH的表达会受到多种microRNA的影响调控，但其具体的分子机制尚未得到完全解析。
本课题组在前期研究中，利用基因芯片技术检测性发育不同时期的小鼠下丘脑中miR-29家族的表达变化发现，随着性发育的成熟，miR-29家族的表达也随之增加；这一结果用实时荧光定量PCR进行了验证，提示miR-29家族可能参与小鼠性发育的调控。本课题组利用CRISPR-Cas9技术同时敲除GT1-7细胞中的miR-29家族后，发现与性发育相关的基因GnRH表达显著增加；进一步研究发现转录因子Tbx21作为miR-29的靶基因，可以直接参与GnRH的表达调控。然而在GT1-7细胞中过表达Tbx21却并不能完全达到由miR-29敲除所引起的GnRH上升的程度，推测还有其它miR-29靶基因参与GnRH的表达调控。由于表观遗传修饰是GnRH神经元成熟过程中的重要调控机制之一，而miR-29也被证明靶向多种DNA甲基化修饰酶基因如Dnmt3a/b、Tet1/2/3等，其中研究较多的Dnmt3a介导DNA从头甲基化，而Tet1主要参与DNA羟甲基化的过程。因此，猜想miR-29可能通过靶向调控Dnmt3a/Tet1参与影响GnRH的表达。
方法：有文献报道GnRH基因的近启动子区-1005~+1bp是该基因反式调控元件集中的区域，也是DNA甲基化调控的主要区域。因此，本研究选取GnRH基因-1005~+1区段作为研究对象，预测出7个发生甲基化修饰的CpG位点。利用重亚硫酸盐处理GT1-7细胞和miR-29敲除的GT1-7（miR-29KO-GT1-7）细胞的基因组DNA，对目标区段设计甲基化引物，重亚硫酸盐测序（BSP）结合二代测序技术比较这两种细胞中GnRH启动子-1005~+1区的7个CpG位点甲基化水平。同时利用DNA甲基转移酶特异性抑制剂（5-Aza-2-dC）处理miR-29KO-GT1-7细胞，确认DNA甲基化是否参与调控GnRH的表达。根据二代测序结果，在甲基化差异显著的特定位点（CpG6）附近设计sgRNA，并利用CRISPR-dCas9技术在此位点特异性富集miR-29的靶基因Dnmt3a/Tet1，双载体分别共转染miR-29KO-GT1-7及GT1-7细胞后，经流式分选技术富集荧光阳性细胞，BSP结合二代测序检测GnRH启动子区的甲基化水平变化，同时实时荧光定量PCR检测GnRH在mRNA水平的变化，以验证CpG6位点的甲基化水平和GnRH表达量之间的相关性。
结果：野生型GT1-7及miR-29KO-GT1-7细胞的GnRH启动子区的二代测序结果显示，-1005~+1bp的7个CpG位点信息完整，其中在miR-29KO-GT1-7细胞内，CpG6位点的甲基化水平较其他位点为最低，为51.28%；同时实时荧光定量PCR数据显示，miR-29KO-GT1-7中GnRH的表达较对照组相比增加50%（P＜0.05）。5μM的5-Aza-2-dC处理miR-29KO-GT1-7细胞后，CpG6位点甲基化水平下降20%，GnRH表达上升50%（P＜0.05）。之后将CpG6位点作为研究重点，在CpG6位点附近分别特异性富集Dnmt3a/Tet1后，二代测序结果显示，转染Dnmt3a载体的miR-29KO-GT1-7实验组中，dCas9-Dnmt3a+sgRNA-CpG6组的甲基化水平变化最大，为68.38%，较其他组上升约17%；同时实时荧光定量PCR数据显示，该组的GnRH表达显著降低40%（P＜0.01）。同样在转染Tet1载体的GT1-7实验组中发现，dCas9-Tet1+sgRNA-CpG6组的甲基化水平最低，为57.69%，较其他组下降约20%；实时荧光定量PCR数据显示，dCas9-Tet1+sgRNA-CpG6组中GnRH表达显著增加50%（P＜0.05）。而尝试在其他位点（CpG2）富集Dnmt3a/Tet1，并未得到上述明显的变化。
结论：本研究结果表明miR-29可通过靶向与表观遗传修饰相关的基因Dnmt3a/Tet1改变GnRH基因启动子调控区的甲基化程度，从而参与调控GnRH基因的表达；而GnRH基因近启动子区域特定CpG位点的甲基化水平的变化会显著影响该基因的表达，这对未来研究表观遗传修饰与性发育之间的分子调控机制具有一定的指导意义。
本课题组在前期研究中，利用基因芯片技术检测性发育不同时期的小鼠下丘脑中miR-29家族的表达变化发现，随着性发育的成熟，miR-29家族的表达也随之增加；这一结果用实时荧光定量PCR进行了验证，提示miR-29家族可能参与小鼠性发育的调控。本课题组利用CRISPR-Cas9技术同时敲除GT1-7细胞中的miR-29家族后，发现与性发育相关的基因GnRH表达显著增加；进一步研究发现转录因子Tbx21作为miR-29的靶基因，可以直接参与GnRH的表达调控。然而在GT1-7细胞中过表达Tbx21却并不能完全达到由miR-29敲除所引起的GnRH上升的程度，推测还有其它miR-29靶基因参与GnRH的表达调控。由于表观遗传修饰是GnRH神经元成熟过程中的重要调控机制之一，而miR-29也被证明靶向多种DNA甲基化修饰酶基因如Dnmt3a/b、Tet1/2/3等，其中研究较多的Dnmt3a介导DNA从头甲基化，而Tet1主要参与DNA羟甲基化的过程。因此，猜想miR-29可能通过靶向调控Dnmt3a/Tet1参与影响GnRH的表达。
方法：有文献报道GnRH基因的近启动子区-1005~+1bp是该基因反式调控元件集中的区域，也是DNA甲基化调控的主要区域。因此，本研究选取GnRH基因-1005~+1区段作为研究对象，预测出7个发生甲基化修饰的CpG位点。利用重亚硫酸盐处理GT1-7细胞和miR-29敲除的GT1-7（miR-29KO-GT1-7）细胞的基因组DNA，对目标区段设计甲基化引物，重亚硫酸盐测序（BSP）结合二代测序技术比较这两种细胞中GnRH启动子-1005~+1区的7个CpG位点甲基化水平。同时利用DNA甲基转移酶特异性抑制剂（5-Aza-2-dC）处理miR-29KO-GT1-7细胞，确认DNA甲基化是否参与调控GnRH的表达。根据二代测序结果，在甲基化差异显著的特定位点（CpG6）附近设计sgRNA，并利用CRISPR-dCas9技术在此位点特异性富集miR-29的靶基因Dnmt3a/Tet1，双载体分别共转染miR-29KO-GT1-7及GT1-7细胞后，经流式分选技术富集荧光阳性细胞，BSP结合二代测序检测GnRH启动子区的甲基化水平变化，同时实时荧光定量PCR检测GnRH在mRNA水平的变化，以验证CpG6位点的甲基化水平和GnRH表达量之间的相关性。
结果：野生型GT1-7及miR-29KO-GT1-7细胞的GnRH启动子区的二代测序结果显示，-1005~+1bp的7个CpG位点信息完整，其中在miR-29KO-GT1-7细胞内，CpG6位点的甲基化水平较其他位点为最低，为51.28%；同时实时荧光定量PCR数据显示，miR-29KO-GT1-7中GnRH的表达较对照组相比增加50%（P＜0.05）。5μM的5-Aza-2-dC处理miR-29KO-GT1-7细胞后，CpG6位点甲基化水平下降20%，GnRH表达上升50%（P＜0.05）。之后将CpG6位点作为研究重点，在CpG6位点附近分别特异性富集Dnmt3a/Tet1后，二代测序结果显示，转染Dnmt3a载体的miR-29KO-GT1-7实验组中，dCas9-Dnmt3a+sgRNA-CpG6组的甲基化水平变化最大，为68.38%，较其他组上升约17%；同时实时荧光定量PCR数据显示，该组的GnRH表达显著降低40%（P＜0.01）。同样在转染Tet1载体的GT1-7实验组中发现，dCas9-Tet1+sgRNA-CpG6组的甲基化水平最低，为57.69%，较其他组下降约20%；实时荧光定量PCR数据显示，dCas9-Tet1+sgRNA-CpG6组中GnRH表达显著增加50%（P＜0.05）。而尝试在其他位点（CpG2）富集Dnmt3a/Tet1，并未得到上述明显的变化。
结论：本研究结果表明miR-29可通过靶向与表观遗传修饰相关的基因Dnmt3a/Tet1改变GnRH基因启动子调控区的甲基化程度，从而参与调控GnRH基因的表达；而GnRH基因近启动子区域特定CpG位点的甲基化水平的变化会显著影响该基因的表达，这对未来研究表观遗传修饰与性发育之间的分子调控机制具有一定的指导意义。