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氧化三甲胺(TMAO)是肠道菌群代谢物,已被证实与心血管疾病、动脉粥样硬化、肥胖、糖尿病、慢性肾病、非酒精性肝脏疾病、阿尔兹海默病,周围动脉疾病、肿瘤等疾病的发生发展有着密切关系,但与衰老包括脑老化的关系,目前国内外尚无相关文献报道,因此本课题拟通过健康人血浆TMAO水平与增龄的关系以及TMAO干预对小鼠脑老化及其学习记忆等认知功能影响研究,探讨TMAO是否能促进脑老化的进程及其可能机制,为肠道菌群代谢产物与脑老化关系的研究提供新的思路和防治策略.
第一部分 老年人血浆肠道菌群代谢物氧化三甲胺(TMAO)水平研究
目的:通过测定健康青壮年和健康老年人血浆氧化三甲胺(TMAO)水平,研究血浆TMAO含量与增龄的关系.
方法:收集福建医科大学附属协和医院健康体检中心愿意加入参与研究的正常健康志愿者,性别匹配,研究对象按年龄分为:青年组(18-44周岁)、中年组(45-64周岁)和老年组(≥65周岁).用液相色谱串联质谱法(LC/MS/MS)进行血浆TMAO含量测定.
结果:本研究共纳入272例健康志愿者,男146例,女126例,其中青年组121例,中年组66例和老年组85例.结果:老年组血浆TMAO水平(7.31±7.98μmol/L)分别高于青年组(3.19±3.49μmol/L)(p＜0.01)和中年组(4.56±5.69μmol/L)(p<0.05),中年组血浆TMAO水平虽有升高,但与青年组比较,不具有显著性差异(p>0.05).线性回归分析显示,血浆TMAO水平与年龄呈正相关(r2=0.1257,p＜0.01).
结论:健康老年人血浆TMAO水平升高.
第二部分 外源性TMAO干预对小鼠脑老化进程及认知功能影响的研究
目的:通过外源性TMAO干预24周龄快速老化小鼠(SAMP8)和抗快速老化小鼠(SAMR1)16周后,观察脑老化相关指标变化和伴随的学习认知功能改变,以研究TMAO对小鼠脑老化及学习记忆等相关认知功能的影响.
方法:雄性、24周龄的SAMP8小鼠和SAMR1小鼠分别随机分为TMAO组和Control组,共4组:SAMP8-TMAO组(P8-T),SAMP8-Control组(P8-C),SAMR1-TMAO组(R1-T)和SAMR1-Control组(R1-C),每组n=12,动态观察小鼠的一般情况和体质量变化,干预结束后测定各组小鼠血浆TMAO水平(液相色谱串联质谱法)、学习记忆等认知功能改变(Y迷宫和Morris水迷宫测试)、海马区细胞衰老及其类型鉴别(衰老相关β-半乳糖苷酶染色(SA-β-Gal)、SA-β-Gal+免疫组化双染)、海马CA1区超微结构变化和海马区突触相关蛋白(Synaptophysin、PSD-95、NMDAR1)的表达变化(免疫组化、Western-blotting).
结果:1、血浆TMAO水平:P8-C组明显高于R1-C组,R1-T组明显高于R1-C组,P8-T组明显高于P8-C组,以P8-T组升高最明显.2、体质量:随周龄增加,P8-C组明显低于R1-C组,R1-T组明显低于R1-C组,P8-T组明显低于P8-C组,R1-T组和P8-T组无显著差异.3、学习认知功能:P8-C组比R1-C组明显降低,R1-T组比R1-C组明显降低,P8-T组比P8-C组明显降低,P8-T组下降最明显.4、小鼠皮层背外侧部位和海马CA3区衰老细胞:R1-C组仅少量的衰老阳性细胞,P8-C组有所增多;R1-T组和P8-T组显著增多,以P8-T组增多最明显.5、衰老细胞的类型:衰老细胞进行SA-β-Gal+免疫组化双染,SA-β-Gal+神经元细胞标志物(NeuN)免疫组化阳性,而SA-β-Gal+星形胶质细胞标志物(GFAP)免疫组化阴性,SA-β-Gal+小胶质细胞标志物(Iba-1/AIF1)免疫组化阴性,说明:衰老细胞多为神经元细胞.6、海马CA1区超微结构变化:R1-C组小鼠线粒体超微结构完整,未见脂褐素,突触形态正常;P8-C组小鼠线粒体轻微受损,少量散在脂褐素,突触形态有所改变;R1-T组和P8-T组小鼠线粒体受损明显,可见大量脂褐素,突触结构明显异常,P8-T组小鼠线粒体受损较R1-T组严重,大量脂褐素聚集成块,突触结构破坏严重.7、海马区突触相关蛋白(Synaptophysin、PSD-95、NMDAR1)表达水平:P8-C组明显低于R1-C组,R1-T组明显低于R1-C组,P8-T组明显低于P8-C组,以P8-T组降低最明显.
结论:TMAO可加速并加重小鼠脑老化的发生与发展,其机制可能与TMAO:(1)诱导海马CA3区神经元细胞衰老;(2)引起海马CA1区突触和锥体细胞内的线粒体损害和脂褐素沉积增加;(3)下调小鼠海马区突触相关蛋白(SYN、PSD-95和NMDAR1)表达有关.
第三部分 外源性TMAO对脑老化进程及认知功能影响的可能机制
目的:测定小鼠脑组织皮层氧化应激水平(过氧化氢含量)和抗氧化水平(超氧化物歧化酶SOD活性),检测海马区mTOR/4EBP2/p70S6K信号通路蛋白表达变化,以探讨TMAO促进小鼠脑老化及其学习认知功能障碍的可能机制.
方法:检测小鼠脑组织皮层过氧化氢水平(比色法)和总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性(羟胺法);采用Western-blotting和Real-time PCR方法分别测定mTOR/4EBP2/p70S6K信号通路蛋白表达及其mRNA转录水平变化.
结果:1、皮层过氧化氢水平:P8-C组明显高于R1-C组,R1-T组明显高于R1-C组,P8-T组明显高于P8-C组,以P8-T组升高最明显.2、皮层总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性:P8-C组明显低于R1-C组,R1-T组明显低于R1-C组,P8-T组明显低于P8-C组,以P8-T组下降最明显.3、mTOR、4EBP2、p70S6K的总蛋白mRNA转录和表达水平在各组间无显著性差异;上述磷酸化蛋白(p-mTOR,p-4EBP1和p-p70S6K)表达水平:P8-C组明显低于R1-C组,R1-T组明显低于R1-C组,P8-T组明显低于P8-C组,以P8-T组下降最明显.
结论:TMAO可能通过升高小鼠皮层氧化应激水平、降低抗氧化能力,抑制mTOR/4EBP2/p70S6K信号通路蛋白磷酸化等机制,促进小鼠脑老化和认知功能障碍.
第一部分 老年人血浆肠道菌群代谢物氧化三甲胺(TMAO)水平研究
目的:通过测定健康青壮年和健康老年人血浆氧化三甲胺(TMAO)水平,研究血浆TMAO含量与增龄的关系.
方法:收集福建医科大学附属协和医院健康体检中心愿意加入参与研究的正常健康志愿者,性别匹配,研究对象按年龄分为:青年组(18-44周岁)、中年组(45-64周岁)和老年组(≥65周岁).用液相色谱串联质谱法(LC/MS/MS)进行血浆TMAO含量测定.
结果:本研究共纳入272例健康志愿者,男146例,女126例,其中青年组121例,中年组66例和老年组85例.结果:老年组血浆TMAO水平(7.31±7.98μmol/L)分别高于青年组(3.19±3.49μmol/L)(p＜0.01)和中年组(4.56±5.69μmol/L)(p<0.05),中年组血浆TMAO水平虽有升高,但与青年组比较,不具有显著性差异(p>0.05).线性回归分析显示,血浆TMAO水平与年龄呈正相关(r2=0.1257,p＜0.01).
结论:健康老年人血浆TMAO水平升高.
第二部分 外源性TMAO干预对小鼠脑老化进程及认知功能影响的研究
目的:通过外源性TMAO干预24周龄快速老化小鼠(SAMP8)和抗快速老化小鼠(SAMR1)16周后,观察脑老化相关指标变化和伴随的学习认知功能改变,以研究TMAO对小鼠脑老化及学习记忆等相关认知功能的影响.
方法:雄性、24周龄的SAMP8小鼠和SAMR1小鼠分别随机分为TMAO组和Control组,共4组:SAMP8-TMAO组(P8-T),SAMP8-Control组(P8-C),SAMR1-TMAO组(R1-T)和SAMR1-Control组(R1-C),每组n=12,动态观察小鼠的一般情况和体质量变化,干预结束后测定各组小鼠血浆TMAO水平(液相色谱串联质谱法)、学习记忆等认知功能改变(Y迷宫和Morris水迷宫测试)、海马区细胞衰老及其类型鉴别(衰老相关β-半乳糖苷酶染色(SA-β-Gal)、SA-β-Gal+免疫组化双染)、海马CA1区超微结构变化和海马区突触相关蛋白(Synaptophysin、PSD-95、NMDAR1)的表达变化(免疫组化、Western-blotting).
结果:1、血浆TMAO水平:P8-C组明显高于R1-C组,R1-T组明显高于R1-C组,P8-T组明显高于P8-C组,以P8-T组升高最明显.2、体质量:随周龄增加,P8-C组明显低于R1-C组,R1-T组明显低于R1-C组,P8-T组明显低于P8-C组,R1-T组和P8-T组无显著差异.3、学习认知功能:P8-C组比R1-C组明显降低,R1-T组比R1-C组明显降低,P8-T组比P8-C组明显降低,P8-T组下降最明显.4、小鼠皮层背外侧部位和海马CA3区衰老细胞:R1-C组仅少量的衰老阳性细胞,P8-C组有所增多;R1-T组和P8-T组显著增多,以P8-T组增多最明显.5、衰老细胞的类型:衰老细胞进行SA-β-Gal+免疫组化双染,SA-β-Gal+神经元细胞标志物(NeuN)免疫组化阳性,而SA-β-Gal+星形胶质细胞标志物(GFAP)免疫组化阴性,SA-β-Gal+小胶质细胞标志物(Iba-1/AIF1)免疫组化阴性,说明:衰老细胞多为神经元细胞.6、海马CA1区超微结构变化:R1-C组小鼠线粒体超微结构完整,未见脂褐素,突触形态正常;P8-C组小鼠线粒体轻微受损,少量散在脂褐素,突触形态有所改变;R1-T组和P8-T组小鼠线粒体受损明显,可见大量脂褐素,突触结构明显异常,P8-T组小鼠线粒体受损较R1-T组严重,大量脂褐素聚集成块,突触结构破坏严重.7、海马区突触相关蛋白(Synaptophysin、PSD-95、NMDAR1)表达水平:P8-C组明显低于R1-C组,R1-T组明显低于R1-C组,P8-T组明显低于P8-C组,以P8-T组降低最明显.
结论:TMAO可加速并加重小鼠脑老化的发生与发展,其机制可能与TMAO:(1)诱导海马CA3区神经元细胞衰老;(2)引起海马CA1区突触和锥体细胞内的线粒体损害和脂褐素沉积增加;(3)下调小鼠海马区突触相关蛋白(SYN、PSD-95和NMDAR1)表达有关.
第三部分 外源性TMAO对脑老化进程及认知功能影响的可能机制
目的:测定小鼠脑组织皮层氧化应激水平(过氧化氢含量)和抗氧化水平(超氧化物歧化酶SOD活性),检测海马区mTOR/4EBP2/p70S6K信号通路蛋白表达变化,以探讨TMAO促进小鼠脑老化及其学习认知功能障碍的可能机制.
方法:检测小鼠脑组织皮层过氧化氢水平(比色法)和总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性(羟胺法);采用Western-blotting和Real-time PCR方法分别测定mTOR/4EBP2/p70S6K信号通路蛋白表达及其mRNA转录水平变化.
结果:1、皮层过氧化氢水平:P8-C组明显高于R1-C组,R1-T组明显高于R1-C组,P8-T组明显高于P8-C组,以P8-T组升高最明显.2、皮层总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性:P8-C组明显低于R1-C组,R1-T组明显低于R1-C组,P8-T组明显低于P8-C组,以P8-T组下降最明显.3、mTOR、4EBP2、p70S6K的总蛋白mRNA转录和表达水平在各组间无显著性差异;上述磷酸化蛋白(p-mTOR,p-4EBP1和p-p70S6K)表达水平:P8-C组明显低于R1-C组,R1-T组明显低于R1-C组,P8-T组明显低于P8-C组,以P8-T组下降最明显.
结论:TMAO可能通过升高小鼠皮层氧化应激水平、降低抗氧化能力,抑制mTOR/4EBP2/p70S6K信号通路蛋白磷酸化等机制,促进小鼠脑老化和认知功能障碍.