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体细胞核移植或称克隆(somatic cell nuclear transfer,SCNT)技术已经广泛应用于生物医药的各个领域。在通常情况下,体细胞核移植或称克隆是采用来源于同一物种或亚种的供体细胞与受体卵母细胞进行的。以不同物种或同一物种内不同亚种间来源的供体细胞和卵母细胞所进行的异种或异亚种克隆效率依然偏低。众所周知,成功的体细胞核移植有赖于受体卵母细胞支持供体细胞的基因组重编程从而去分化恢复到支持胚胎发育的全能性状态,这就要求供体细胞与受体卵母细胞之间具有正常的相互作用。目前,人们已经从表观遗传学如,DNA甲基化修饰、组蛋白修饰,以及卵母细胞重编程供体细胞效能等方面对影响种内,种间,以及亚种内和亚种间克隆效率的因素进行了一系列深入的研究。但是,对于影响异种间和异亚种间体细胞核移植效率的分子机理,诸如核-质互作、供体细胞-受体卵母细胞线粒体相容性等方面,人们还缺乏了解。
作为高等动物中唯一核外遗传物质的线粒体,是胞浆中最丰富的细胞器。它是细胞进行能量代谢,有氧呼吸、电子传递-氧化磷酸化,维持细胞正常生理机能的“动力工厂”。在参与线粒体生物合成及正常生理功能行使的蛋白质中约有1,500种是由核基因组负责编码的。也就是说,其正常功能的行使受到了核基因组和线粒体基因组(mtDNA)的双重控制。因此,要维持线粒体的正常功能就要求细胞核与胞浆中的线粒体之间必须有广泛的相容性。这就为人们研究核-质互作提供了良好的模型。
在本课题的研究中,我们首先通过双重PCR-RFLP技术对2104头实验动物(1635头荷斯坦奶牛和469头鲁西黄牛)进行了线粒体DNA单倍型的分型鉴定。并摸索了应用高分辨熔解曲线突变检测(High-resolution melting,HRM)方法,对实验动物进行高通量、高稳定性,快速大规模检测线粒体基因突变的新技术。在鉴定得到的线粒体四种单倍型中,以A-型和B-型两种单倍型为主。我们以来源于两个不同亚种牛的卵母细胞作为受体胞质,以荷斯坦奶牛来源的牛耳成纤维细胞作为供体细胞,进行荷斯坦奶牛体细胞核移植实验,探讨了用鲁西黄牛代替荷斯坦奶牛作卵母细胞供体,来克隆荷斯坦奶牛的可行性。同时,以两个不同亚种牛作代孕牛,与不同亚种牛卵母细胞生成的克隆胚互相组合,进行胚胎移植,进一步分析不同亚种牛卵母细胞构成的克隆胚移植于不同亚种的代孕牛后,影响妊娠效率的可能因素,为开展牛的异亚种间核移植提供了科学资料。最后,我们将荷斯坦奶牛来源的A-线粒体DNA单倍型的供体细胞分别移植到不同单倍型(A-型和B-型)的荷斯坦奶牛或鲁西黄牛的卵母细胞中,分析比较了二者在融合率、分裂率、囊胚率等体外发育效率方面的异同；以及在将不同牛亚种卵母细胞来源克隆囊胚移植给代孕牛后,二者在妊娠率、产犊率以及活产率等方面体内发育效率方面的差异。通过比较不同牛亚种来源重构胚中ATP含量、全基因组H3-K9甲基化状态以及胚胎发育多能性相关基因Oct4,Sox2和Nanog启动子区DNA甲基化水平,验证了供体细胞-受体卵母细胞间mtDNA单倍型相容性对牛异亚种间体细胞核移植的效率具有重要影响。我们的实验表明,鲁西黄牛来源的卵母细胞同样可以用作受体胞质进行荷斯坦奶牛的体细胞核移植。本研究为应用体细胞核移植技术,开展濒危物种保护,跨物种和亚种间克隆提供了实验依据。