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第一部分神经元内apoE4(Δ272-299)触发内质网应激的效应
背景：阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种与年龄相关的常见神经退行性疾病。目前有多种假说尝试揭示AD的致病机制。其中被广泛接受的是基因遗传学说。当前学界内最具有公认性的易感基因之一为载脂蛋白E4(apolipoprotein E4, apoE4)基因。ApoE4已被视为AD最重要的遗传危险因素之一。ApoE4作为一种载脂蛋白，在正常生理状态下，主要行使细胞或组织之间胆固醇、磷脂及甘油三酯等脂类物质的转运功能。但近年来的大量研究发现，神经元特异性表达apoE4可导致转基因鼠脑内出现AD样病理学改变和学习记忆损伤，而在星形胶质细胞表达apoE4转基因鼠中观察不到该现象。这提示：apoE4对神经元功能的影响具有神经元特异性。又有研究显示：神经元内存在特异性的apoE蛋白裂解酶，可在Met272位点切割apoE4产生apoE4(Δ272-299)。人类apoE存在apoE2、apoE3、apoE4三种亚型，其中仅发现apoE4存在针对该蛋白裂解酶异常敏感位点，在其它apoE亚型中并未发现。有研究显示：apoE4(Δ272-299)是apoE4在神经元中产生的一种毒性片段。在神经元内特异性表达apoE4的转基因鼠和AD患者脑内，均发现了apoE4(Δ272-299)的存在。进一步研究发现，apoE4转基因鼠脑内apoE4(Δ272-299)的存在与其脑内学习记忆功能障碍、神经元变性等病理现象密切相关。总之，既往研究表明：神经元内apoE4(Δ272-299)可能是apoE4致AD病变的主要效应分子。
近年来，大量研究已经证实内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)在AD中发挥着至关重要的致病作用。在外界刺激因素作用下，内质网中新生蛋白的折叠修饰或组装发生异常，导致未折叠或错误折叠的蛋白质在ER中累积，从而使细胞产生ERS。在神经元内异常滞留存在的apoE4(Δ272-299)是否与ERS之间存在联系？其作用机制如何？这些科学问题均有待进一步阐明。
本研究从动物及细胞两个不同层面建立模型，旨在探讨神经元内apoE4(Δ272-299)对ERS的影响，并进一步在apoE4(Δ272-299)转基因小鼠中，观察神经元特异性表达apoE4(Δ272-299)对模型鼠学习记忆及空间探索能力的影响。
实验方法：首先，我们以小鼠神经母细胞瘤(Neuro-2a，N2a)细胞为实验对象，分别采用本实验室既往构建并保存的pIRES-EGFP-apoE4(简称p-EGFP-apoE4)、pIRES-EGFP-apoE4(Δ272-299)((简称p-EGFP-apoE4(Δ272-299))重组质粒建立体外细胞干预模型，采用逆转录实时定量PCR技术，检测ERS标记蛋白GRP78、GRP75和CHOPmRNA水平变化；采用Western-blot技术，检测ERS标记蛋白GRP78、GRP75和CHOP蛋白水平变化。其次，采用ERS保护剂PBA进行干预处理，分别检测上述细胞模型中ERS标记蛋白的mRNA水平和蛋白水平变化，以进一步佐证apoE4(Δ272-299)所致的ERS活化。随后，为验证上述细胞实验结果，我们进一步以神经元特异性表达人apoE4(Δ272-299)转基因鼠为动物模型，检测ERS标记蛋白GRP78、GRP75和CHOP的mRNA水平和蛋白水平表达变化。此外，我们进一步运用Morris水迷宫实验，检测上述转基因模型小鼠的学习记忆及空间探索能力。
结果：首先，在N2a细胞模型中，我们发现，与正常对照组相比，N2a细胞转染p-EGFP-apoE4(Δ272-299)后，ERS标记蛋白GRP78、GRP75和CHOPmRNA表达水平显著增高，蛋白表达水平也显著增加；但过表达全长apoE4并未导致上述ERS标记分子mRNA和蛋白水平的改变。此外，针对N2a细胞转染p-EGFP-apoE4(Δ272-299)后，采用ERS保护剂PBA，我们发现GRP78、GRP75和CHOPmRNA和蛋白表达水平均显著下调。其次，在apoE4(Δ272-299)转基因模型小鼠中，我们发现：相比野生型对照小鼠而言，模型鼠海马组织中ERS标记蛋白GRP78、GRP75和CHOPmRNA和蛋白水平的表达变化与上述细胞模型结果相一致。最后，为进一步观察具有神经毒性作用的apoE4(Δ272-299)是否导致转基因模型小鼠学习记忆障碍和空间探索能力障碍，我们运用Morris水迷宫实验手段进行行为学实验，结果表明：转基因模型小鼠相比正常对照组，需要花费更长的时间才能找到平台，同时，apoE4(Δ272-299)转基因模型小鼠呆在目标象限的时间也显著短于正常对照组小鼠。上述结果表明，神经元特异性apoE4(Δ272-299)可导致小鼠学习记忆行为学障碍。
结论：神经元特异性表达apoE4(Δ272-299)可触发ERS，导致学习记忆能力障碍，具有神经元毒性效应。
第二部分神经元内apoE4(Δ272-299)触发ERS致线粒体形态功能紊乱的作用机制
背景：线粒体是细胞的代谢中心和能量工厂，为细胞提供生物合成所需的底物和能量，对细胞的命运起着决定作用。线粒体在细胞内保持不断融合与分裂的动态平衡，从而决定线粒体的数目、形态及分布，是线粒体发挥其功能的前提条件。当线粒体融合与分裂的动态平衡失调，线粒体形态和功能均会受到损害。线粒体形态功能受损是AD的一种早期病理特征。关于apoE4介导线粒体功能障碍参与AD致病的机制研究，目前仍不明确。既往研究发现，在携带apoE4基因的AD患者及神经元过表达apoE4的转基因鼠中线粒体功能紊乱的出现早于AD病理改变。另外，也有研究发现apoE4对线粒体的损伤可能同样具有神经元特异性。在神经元中，相比apoE3而言，apoE4可引起神经元中线粒体呼吸复合体亚基表达显著下调，但在星形胶质细胞中未检测到此现象。ApoE4引起神经元线粒体呼吸链功能障碍可能与其自身独特的结构域间相互作用相关。采用缺乏自身结构域相互作用的突变体apoE4，在N2a细胞中难以诱导线粒体功能障碍。进一步研究发现，apoE4在神经元细胞中可被蛋白裂解酶切割成具有毒性作用的apoE4(Δ272-299)片段。研究发现这种毒性片段在神经元内过表达后，对神经元细胞中线粒体呼吸链相关复合体的损伤作用要比单纯的全长apoE4更严重。我们推测这种全长apoE4在神经元细胞中可能通过产生apoE4(Δ272-299)毒性效应分子发挥线粒体的毒性作用。既往的研究较多关注apoE4(Δ272-299)片段对线粒体呼吸作用的影响，而对神经元线粒体形态和功能的影响，目前仍然未知。
本研究旨在通过神经元特异性apoE4(Δ272-299)转基因小鼠模型及细胞模型，探讨apoE4(Δ272-299)片段对神经元线粒体形态和功能的影响。
实验方法：首先，我们采用高分辨透射电子显微镜，观察apoE4(Δ272-299)转基因模型小鼠海马组织中线粒体的形态变化；采用Western-blot技术，检测转基因模型小鼠海马组织中线粒体融合与分裂相关标记蛋白的蛋白表达水平变化。其次，为进一步验证上述结果，我们以N2a细胞为实验对象，分别瞬时转染pIRES空载体及pIRES-EGFP-apoE4(Δ272-299)真核表达质粒，采用激光共聚焦显微技术，观察转染后N2a细胞中线粒体的形态变化；采用Western-blot技术，检测N2a细胞中线粒体融合与分裂相关标记蛋白的蛋白水平表达变化。随后，为探讨apoE4(Δ272-299)片段对线粒体功能的影响，我们采用JC-1法检测细胞模型的线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)；采用化学发光法检测线粒体ATP的生成；采用荧光分光光度计法检测细胞内ROS的水平。最后，我们采用ERS保护剂PBA处理上述细胞模型，进一步验证apoE4(Δ272-299)毒性片段对线粒体形态和功能的影响是否与触发ERS有关。
结果：首先，在转基因模型小鼠海马组织内，透射电镜的结果显示海马神经元内线粒体嵴断裂或消失，线粒体发生片段化明显增加。进一步检测其线粒体融合与分裂动力学相关蛋白后发现，线粒体融合蛋白1(Mitofusin 1，MFN1)、线粒体融合蛋白2(Mitofusin 2，MFN2)及视神经萎缩蛋白1(Optic atrophy 1， OPA1 )等线粒体融合标记分子蛋白表达水平显著下降，而线粒体裂变因子(Mitochondrial fission factor，MFF)蛋白表达水平显著增高、动力相关蛋白1(Dynamin-related protein 1，DRP1)的Ser616位点磷酸化水平也显著增高。其次，在细胞模型中，我们发现，与正常对照组相比，apoE4(Δ272-299)转染组线粒体的平均长度显著下降，其细胞线粒体融合与分裂相关标记蛋白的表达变化与上述转基因模型小鼠结果一致。我们进一步对线粒体功能进行检测，发现apoE4(Δ272-299)转染组线粒体MMP显著降低、ATP生成显著减少，细胞内ROS水平显著升高。最后，我们进一步采用ERS保护剂PBA处理上述细胞模型后，发现PBA处理组可显著缓解apoE4(Δ272-299)过表达所致的线粒体片段化，线粒体的平均长度较转染组显著增长，线粒体融合相关蛋白表达水平显著增加，同时线粒体分裂蛋白表达水平降低；同时，PBA处理后可显著提高线粒体膜电位及ATP的合成水平，并显著减少细胞ROS的产生。
结论：神经元特异性表达apoE4(Δ272-299)片段可通过触发ERS导致神经元线粒体的形态及功能紊乱。
第三部分内质网-线粒体偶联在apoE4(Δ272-299)致线粒体形态功能障碍中的作用机制
背景：内质网(endoplasmic reticulum，ER)是真核生物细胞中膜面积最大的细胞器，其在细胞质中形成广泛而复杂的网络状结构，并具有各自不同功能的特定亚区域，这使得ER能与其它各种细胞器和细胞质膜建立特定膜偶联位点，这些偶联位点在内质网与其它细胞器间传递信号中发挥着重要作用。在真核细胞中，线粒体和ER作为细胞内两种重要的细胞器，并非完全独立存在。早期的研究已经发现线粒体和ER之间存在局部相互平行接触的区域，但并未意识到这些密切接触的区域在细胞中起着何种作用。近几年的研究表明，这些ER和线粒体间密切连接的结构偶联部位，即线粒体相关内质网膜(mitochondria-associated ER membrane，MAM)，在ER和线粒体间信息交换及物质传递中发挥着至关重要的作用，其结构异常可广泛参与各种疾病的发生。MAM在神经退行性疾病，尤其是AD中的作用已成为该领域的研究热点问题之一。
ER作为Ca2+的重要储存库，维持并调节细胞内钙的平衡。内质网和线粒体作为细胞内密切偶联的两种细胞器，在外界损伤因素的刺激下，ER中的Ca2+过度释放进入胞浆，导致细胞钙超载，超载的Ca2+可借助MAM进入线粒体，从而导致线粒体内Ca2+稳态失衡。近年来大量的证据证实MAM在介导内质网释放的钙离子进入线粒体，调控线粒体内Ca2+稳态中起着重要的作用。MAM功能异常可导致内质网中释放的Ca2+进入线粒体，导致线粒体Ca2+超载，从而触发线粒体功能障碍。
我们在之前的研究已发现，过表达apoE4(Δ272-299)的细胞模型及转基因模型小鼠海马中存在ERS标记分子GRP75显著增高及线粒体形态功能紊乱的现象，且我们前期的研究表明线粒体形态与功能紊乱发生在ERS之后，但其机制未明。神经元细胞在受到apoE4(Δ272-299)片段的毒性作用后触发的ERS是通过何种途径影响到线粒体形态和功能，这是我们所关心的问题。鉴于MAM作为线粒体与ER间重要的“交流平台”，MAM对线粒体具有重要的调控作用，我们推测MAM可能参与了这种ERS信号的传递。因此，本部分主要探讨apoE4(Δ272-299)促发ERS后是否通过MAM介导了线粒体形态与功能紊乱，并进一步探讨其可能机制。
方法：首先，我们采用透射电镜技术，观察转基因模型小鼠海马组织中线粒体与内质网间MAM变化。其次，在细胞模型中，采用激光共聚焦显微技术观察转染p-EGFP-apoE4(Δ272-299)表达质粒后，内质网与线粒体间MAM面积变化。另外，借助不同的钙离子探针，采用激光共聚焦显微技术检测转染p-EGFP-apoE4(Δ272-299)表达质粒后，线粒体钙离子变化。进一步采用GRP75抑制剂进行联合干预处理转染p-EGFP-apoE4(Δ272-299)表达质粒后的N2a细胞模型，通过Western-blot技术检测细胞线粒体融合与分裂相关蛋白的表达变化，并进一步检测其线粒体功能改变。最后，采用GRP75siRNA再次验证上述GRP75抑制剂实验结果，分别检测细胞线粒体融合与分裂相关蛋白的表达变化，并进一步检测其线粒体功能改变。
结果：首先，在转基因模型小鼠海马组织内，透射电镜的结果显示线粒体与内质网间的MAM间距显著变窄，MAM区面积显著增大。其次，我们发现，与对照组相比，N2a细胞转染p-EGFP-apoE4(Δ272-299)后，内质网与线粒体MAM区面积增大。但在采用GRP75抑制剂后，与转染组相比其MAM面积有所减小。其次，与对照组相比，转染组细胞内线粒体Ca2+浓度显著增加，出现线粒体Ca2+超载现象。另外，在线粒体分裂融合蛋白表达水平上，转染组细胞出现线粒体分裂蛋白MFF表达水平及DRP1磷酸化水平显著增加，融合蛋白MFN1、MFN2及OPA1表达水平显著下降。在线粒体功能方面，apoE4(Δ272-299)过表达可导致N2a细胞出现线粒体膜电位显著下降，ATP生成量显著减少及ROS显著升高的现象。采用GRP75抑制剂处理后，线粒体融合与分裂的失衡现象得以明显缓解，线粒体膜电位回升，ATP的生成增加，降低细胞ROS产生。采用GRP75siRNA处理后，实验结果一致。
结论：ApoE4(Δ272-299)可通过GRP75桥梁分子参与MAM转运Ca2+到线粒体，从而引起线粒体钙超载，导致线粒体形态和功能紊乱。
背景：阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种与年龄相关的常见神经退行性疾病。目前有多种假说尝试揭示AD的致病机制。其中被广泛接受的是基因遗传学说。当前学界内最具有公认性的易感基因之一为载脂蛋白E4(apolipoprotein E4, apoE4)基因。ApoE4已被视为AD最重要的遗传危险因素之一。ApoE4作为一种载脂蛋白，在正常生理状态下，主要行使细胞或组织之间胆固醇、磷脂及甘油三酯等脂类物质的转运功能。但近年来的大量研究发现，神经元特异性表达apoE4可导致转基因鼠脑内出现AD样病理学改变和学习记忆损伤，而在星形胶质细胞表达apoE4转基因鼠中观察不到该现象。这提示：apoE4对神经元功能的影响具有神经元特异性。又有研究显示：神经元内存在特异性的apoE蛋白裂解酶，可在Met272位点切割apoE4产生apoE4(Δ272-299)。人类apoE存在apoE2、apoE3、apoE4三种亚型，其中仅发现apoE4存在针对该蛋白裂解酶异常敏感位点，在其它apoE亚型中并未发现。有研究显示：apoE4(Δ272-299)是apoE4在神经元中产生的一种毒性片段。在神经元内特异性表达apoE4的转基因鼠和AD患者脑内，均发现了apoE4(Δ272-299)的存在。进一步研究发现，apoE4转基因鼠脑内apoE4(Δ272-299)的存在与其脑内学习记忆功能障碍、神经元变性等病理现象密切相关。总之，既往研究表明：神经元内apoE4(Δ272-299)可能是apoE4致AD病变的主要效应分子。
近年来，大量研究已经证实内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)在AD中发挥着至关重要的致病作用。在外界刺激因素作用下，内质网中新生蛋白的折叠修饰或组装发生异常，导致未折叠或错误折叠的蛋白质在ER中累积，从而使细胞产生ERS。在神经元内异常滞留存在的apoE4(Δ272-299)是否与ERS之间存在联系？其作用机制如何？这些科学问题均有待进一步阐明。
本研究从动物及细胞两个不同层面建立模型，旨在探讨神经元内apoE4(Δ272-299)对ERS的影响，并进一步在apoE4(Δ272-299)转基因小鼠中，观察神经元特异性表达apoE4(Δ272-299)对模型鼠学习记忆及空间探索能力的影响。
实验方法：首先，我们以小鼠神经母细胞瘤(Neuro-2a，N2a)细胞为实验对象，分别采用本实验室既往构建并保存的pIRES-EGFP-apoE4(简称p-EGFP-apoE4)、pIRES-EGFP-apoE4(Δ272-299)((简称p-EGFP-apoE4(Δ272-299))重组质粒建立体外细胞干预模型，采用逆转录实时定量PCR技术，检测ERS标记蛋白GRP78、GRP75和CHOPmRNA水平变化；采用Western-blot技术，检测ERS标记蛋白GRP78、GRP75和CHOP蛋白水平变化。其次，采用ERS保护剂PBA进行干预处理，分别检测上述细胞模型中ERS标记蛋白的mRNA水平和蛋白水平变化，以进一步佐证apoE4(Δ272-299)所致的ERS活化。随后，为验证上述细胞实验结果，我们进一步以神经元特异性表达人apoE4(Δ272-299)转基因鼠为动物模型，检测ERS标记蛋白GRP78、GRP75和CHOP的mRNA水平和蛋白水平表达变化。此外，我们进一步运用Morris水迷宫实验，检测上述转基因模型小鼠的学习记忆及空间探索能力。
结果：首先，在N2a细胞模型中，我们发现，与正常对照组相比，N2a细胞转染p-EGFP-apoE4(Δ272-299)后，ERS标记蛋白GRP78、GRP75和CHOPmRNA表达水平显著增高，蛋白表达水平也显著增加；但过表达全长apoE4并未导致上述ERS标记分子mRNA和蛋白水平的改变。此外，针对N2a细胞转染p-EGFP-apoE4(Δ272-299)后，采用ERS保护剂PBA，我们发现GRP78、GRP75和CHOPmRNA和蛋白表达水平均显著下调。其次，在apoE4(Δ272-299)转基因模型小鼠中，我们发现：相比野生型对照小鼠而言，模型鼠海马组织中ERS标记蛋白GRP78、GRP75和CHOPmRNA和蛋白水平的表达变化与上述细胞模型结果相一致。最后，为进一步观察具有神经毒性作用的apoE4(Δ272-299)是否导致转基因模型小鼠学习记忆障碍和空间探索能力障碍，我们运用Morris水迷宫实验手段进行行为学实验，结果表明：转基因模型小鼠相比正常对照组，需要花费更长的时间才能找到平台，同时，apoE4(Δ272-299)转基因模型小鼠呆在目标象限的时间也显著短于正常对照组小鼠。上述结果表明，神经元特异性apoE4(Δ272-299)可导致小鼠学习记忆行为学障碍。
结论：神经元特异性表达apoE4(Δ272-299)可触发ERS，导致学习记忆能力障碍，具有神经元毒性效应。
第二部分神经元内apoE4(Δ272-299)触发ERS致线粒体形态功能紊乱的作用机制
背景：线粒体是细胞的代谢中心和能量工厂，为细胞提供生物合成所需的底物和能量，对细胞的命运起着决定作用。线粒体在细胞内保持不断融合与分裂的动态平衡，从而决定线粒体的数目、形态及分布，是线粒体发挥其功能的前提条件。当线粒体融合与分裂的动态平衡失调，线粒体形态和功能均会受到损害。线粒体形态功能受损是AD的一种早期病理特征。关于apoE4介导线粒体功能障碍参与AD致病的机制研究，目前仍不明确。既往研究发现，在携带apoE4基因的AD患者及神经元过表达apoE4的转基因鼠中线粒体功能紊乱的出现早于AD病理改变。另外，也有研究发现apoE4对线粒体的损伤可能同样具有神经元特异性。在神经元中，相比apoE3而言，apoE4可引起神经元中线粒体呼吸复合体亚基表达显著下调，但在星形胶质细胞中未检测到此现象。ApoE4引起神经元线粒体呼吸链功能障碍可能与其自身独特的结构域间相互作用相关。采用缺乏自身结构域相互作用的突变体apoE4，在N2a细胞中难以诱导线粒体功能障碍。进一步研究发现，apoE4在神经元细胞中可被蛋白裂解酶切割成具有毒性作用的apoE4(Δ272-299)片段。研究发现这种毒性片段在神经元内过表达后，对神经元细胞中线粒体呼吸链相关复合体的损伤作用要比单纯的全长apoE4更严重。我们推测这种全长apoE4在神经元细胞中可能通过产生apoE4(Δ272-299)毒性效应分子发挥线粒体的毒性作用。既往的研究较多关注apoE4(Δ272-299)片段对线粒体呼吸作用的影响，而对神经元线粒体形态和功能的影响，目前仍然未知。
本研究旨在通过神经元特异性apoE4(Δ272-299)转基因小鼠模型及细胞模型，探讨apoE4(Δ272-299)片段对神经元线粒体形态和功能的影响。
实验方法：首先，我们采用高分辨透射电子显微镜，观察apoE4(Δ272-299)转基因模型小鼠海马组织中线粒体的形态变化；采用Western-blot技术，检测转基因模型小鼠海马组织中线粒体融合与分裂相关标记蛋白的蛋白表达水平变化。其次，为进一步验证上述结果，我们以N2a细胞为实验对象，分别瞬时转染pIRES空载体及pIRES-EGFP-apoE4(Δ272-299)真核表达质粒，采用激光共聚焦显微技术，观察转染后N2a细胞中线粒体的形态变化；采用Western-blot技术，检测N2a细胞中线粒体融合与分裂相关标记蛋白的蛋白水平表达变化。随后，为探讨apoE4(Δ272-299)片段对线粒体功能的影响，我们采用JC-1法检测细胞模型的线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)；采用化学发光法检测线粒体ATP的生成；采用荧光分光光度计法检测细胞内ROS的水平。最后，我们采用ERS保护剂PBA处理上述细胞模型，进一步验证apoE4(Δ272-299)毒性片段对线粒体形态和功能的影响是否与触发ERS有关。
结果：首先，在转基因模型小鼠海马组织内，透射电镜的结果显示海马神经元内线粒体嵴断裂或消失，线粒体发生片段化明显增加。进一步检测其线粒体融合与分裂动力学相关蛋白后发现，线粒体融合蛋白1(Mitofusin 1，MFN1)、线粒体融合蛋白2(Mitofusin 2，MFN2)及视神经萎缩蛋白1(Optic atrophy 1， OPA1 )等线粒体融合标记分子蛋白表达水平显著下降，而线粒体裂变因子(Mitochondrial fission factor，MFF)蛋白表达水平显著增高、动力相关蛋白1(Dynamin-related protein 1，DRP1)的Ser616位点磷酸化水平也显著增高。其次，在细胞模型中，我们发现，与正常对照组相比，apoE4(Δ272-299)转染组线粒体的平均长度显著下降，其细胞线粒体融合与分裂相关标记蛋白的表达变化与上述转基因模型小鼠结果一致。我们进一步对线粒体功能进行检测，发现apoE4(Δ272-299)转染组线粒体MMP显著降低、ATP生成显著减少，细胞内ROS水平显著升高。最后，我们进一步采用ERS保护剂PBA处理上述细胞模型后，发现PBA处理组可显著缓解apoE4(Δ272-299)过表达所致的线粒体片段化，线粒体的平均长度较转染组显著增长，线粒体融合相关蛋白表达水平显著增加，同时线粒体分裂蛋白表达水平降低；同时，PBA处理后可显著提高线粒体膜电位及ATP的合成水平，并显著减少细胞ROS的产生。
结论：神经元特异性表达apoE4(Δ272-299)片段可通过触发ERS导致神经元线粒体的形态及功能紊乱。
第三部分内质网-线粒体偶联在apoE4(Δ272-299)致线粒体形态功能障碍中的作用机制
背景：内质网(endoplasmic reticulum，ER)是真核生物细胞中膜面积最大的细胞器，其在细胞质中形成广泛而复杂的网络状结构，并具有各自不同功能的特定亚区域，这使得ER能与其它各种细胞器和细胞质膜建立特定膜偶联位点，这些偶联位点在内质网与其它细胞器间传递信号中发挥着重要作用。在真核细胞中，线粒体和ER作为细胞内两种重要的细胞器，并非完全独立存在。早期的研究已经发现线粒体和ER之间存在局部相互平行接触的区域，但并未意识到这些密切接触的区域在细胞中起着何种作用。近几年的研究表明，这些ER和线粒体间密切连接的结构偶联部位，即线粒体相关内质网膜(mitochondria-associated ER membrane，MAM)，在ER和线粒体间信息交换及物质传递中发挥着至关重要的作用，其结构异常可广泛参与各种疾病的发生。MAM在神经退行性疾病，尤其是AD中的作用已成为该领域的研究热点问题之一。
ER作为Ca2+的重要储存库，维持并调节细胞内钙的平衡。内质网和线粒体作为细胞内密切偶联的两种细胞器，在外界损伤因素的刺激下，ER中的Ca2+过度释放进入胞浆，导致细胞钙超载，超载的Ca2+可借助MAM进入线粒体，从而导致线粒体内Ca2+稳态失衡。近年来大量的证据证实MAM在介导内质网释放的钙离子进入线粒体，调控线粒体内Ca2+稳态中起着重要的作用。MAM功能异常可导致内质网中释放的Ca2+进入线粒体，导致线粒体Ca2+超载，从而触发线粒体功能障碍。
我们在之前的研究已发现，过表达apoE4(Δ272-299)的细胞模型及转基因模型小鼠海马中存在ERS标记分子GRP75显著增高及线粒体形态功能紊乱的现象，且我们前期的研究表明线粒体形态与功能紊乱发生在ERS之后，但其机制未明。神经元细胞在受到apoE4(Δ272-299)片段的毒性作用后触发的ERS是通过何种途径影响到线粒体形态和功能，这是我们所关心的问题。鉴于MAM作为线粒体与ER间重要的“交流平台”，MAM对线粒体具有重要的调控作用，我们推测MAM可能参与了这种ERS信号的传递。因此，本部分主要探讨apoE4(Δ272-299)促发ERS后是否通过MAM介导了线粒体形态与功能紊乱，并进一步探讨其可能机制。
方法：首先，我们采用透射电镜技术，观察转基因模型小鼠海马组织中线粒体与内质网间MAM变化。其次，在细胞模型中，采用激光共聚焦显微技术观察转染p-EGFP-apoE4(Δ272-299)表达质粒后，内质网与线粒体间MAM面积变化。另外，借助不同的钙离子探针，采用激光共聚焦显微技术检测转染p-EGFP-apoE4(Δ272-299)表达质粒后，线粒体钙离子变化。进一步采用GRP75抑制剂进行联合干预处理转染p-EGFP-apoE4(Δ272-299)表达质粒后的N2a细胞模型，通过Western-blot技术检测细胞线粒体融合与分裂相关蛋白的表达变化，并进一步检测其线粒体功能改变。最后，采用GRP75siRNA再次验证上述GRP75抑制剂实验结果，分别检测细胞线粒体融合与分裂相关蛋白的表达变化，并进一步检测其线粒体功能改变。
结果：首先，在转基因模型小鼠海马组织内，透射电镜的结果显示线粒体与内质网间的MAM间距显著变窄，MAM区面积显著增大。其次，我们发现，与对照组相比，N2a细胞转染p-EGFP-apoE4(Δ272-299)后，内质网与线粒体MAM区面积增大。但在采用GRP75抑制剂后，与转染组相比其MAM面积有所减小。其次，与对照组相比，转染组细胞内线粒体Ca2+浓度显著增加，出现线粒体Ca2+超载现象。另外，在线粒体分裂融合蛋白表达水平上，转染组细胞出现线粒体分裂蛋白MFF表达水平及DRP1磷酸化水平显著增加，融合蛋白MFN1、MFN2及OPA1表达水平显著下降。在线粒体功能方面，apoE4(Δ272-299)过表达可导致N2a细胞出现线粒体膜电位显著下降，ATP生成量显著减少及ROS显著升高的现象。采用GRP75抑制剂处理后，线粒体融合与分裂的失衡现象得以明显缓解，线粒体膜电位回升，ATP的生成增加，降低细胞ROS产生。采用GRP75siRNA处理后，实验结果一致。
结论：ApoE4(Δ272-299)可通过GRP75桥梁分子参与MAM转运Ca2+到线粒体，从而引起线粒体钙超载，导致线粒体形态和功能紊乱。