论文部分内容阅读
高等植物的花发育是其生命过程中最重要的阶段，既受外界环境因素的影响，又受内在基因的调控。高等植物花的发育包括3个顺序发生的过程：开花决定、花的发端和花器官的发育。
MADS—box基因和Homeobox基因是涉及生物个体发育调节的两类重要转录因子编码基因，这两类基因都在花发育过程中起重要作用。DNMADS2和DNKNOX1是本实验室在研究金钗石斛(Dendrobium nobile Lindl)花发育过程中克隆的2个基因。对这两个基因的蛋白序列进行分析，它们分别属于MADS—box基因家族和Homeobox基因家族。为了研究这两个基因的功能，采用基因超表达和RNA干涉技术获得与基因功能相关的证据。本实验室已经建立了金钗石斛类原球茎(PLBs)的遗传转化体系，本论文在此基础上，对三个春石斛杂交种YZXHYS、BCH和—6—VSS的遗传转化体系进一步优化，构建DNMADS2、DNKNOX1的超表达和RNA干涉载体，并转化金钗石斛和3种春石斛杂交种的PLBs，获得的主要结果如下：
1.通过特异引物从金钗石斛中克隆出DNMADS2基因的cDNA，测序结果比对蛋白质序列100％匹配，可以用于下一步操作。
2.利用超表达载体pOx和RNA干涉载体pYLRNAi．5构建了DNMADS2、DNKNOX1超表达和RNA干涉载体。通过测序结果分析，超表达载体的蛋白序列100％匹配，RNA干涉载体的正义和反义片段插入正确，初步推测能够形成茎环结构。
3.优化根癌农杆菌介导的春石斛的遗传转化体系。研究表明，3个不同基因型春石斛的PLBs在同一培养基上的生长状态不一致，对潮霉素的敏感性差异也很大。延迟筛选能明显提高PLBs的存活率，但假阳性率也随之上升。不同基因型春石斛的转化率相差很大。经过优化转化筛选条件后，金钗石斛和春石斛杂交种BCH的转化率较高，平均达25～30％，并且假阳性低，只有7％左右；而春石斛杂交种—6—VSS和YZXHYS的转化率稍低，约15～20％，并且筛选出来的PLBs假阳性较高，YZXHYS最高的达到30％以上。
4.由于目前得到的转化苗很少，只对筛选出来的10个金钗石斛DNMADS2超表达载体的转化PLBs用微量抽提法提取基因组DNA，以潮霉素磷酸转移酶基因的特异扩增引物对转化PLBs进行了PCR检测，全部检测为阳性，初步证明DNMADS2可能已经整合到金钗石斛的基因组DNA中。