论文部分内容阅读
烟草叶绿体有FeSOD和Cu/ZnSOD两种同工酶，它们分别由核基因sodB和sodCp所编码，在叶绿体内协同作用清除O2-。相比叶绿体Cu/ZnSOD，FeSOD在叶绿体内的精确定位还不确定。前人已经作过很多过量表达FeSOD的转基因研究。研究结果表明过量表达FeSOD能够提高MV诱导的氧化胁迫，但是对于FeSOD对光系统的保护作用还不确定。为了阐明FeSOD在光氧化胁迫下对光系统的保护机制，我们构建了烟草叶绿体FeSOD的RNAi载体，得到了FeSOD活性降低的转基因烟草。我们的研究结果表明，转基因烟草对光氧化敏感，转基因烟草的PSⅡ严重损伤。具体的结果如下：
1.我们使用烟草叶绿体FeSOD的RNAi载体转化烟草，从得到的转基因烟草中选出3个独立的株系，它们的FeSOD在mRNA和蛋白水平上得到高度的抑制。通过自交得到T2代烟草用于生理、生化试验。在100μmol m-2s-1的光强下，转基因烟草的幼叶发黄，它们的叶绿素含量和PSⅡ的最大光化学效率显著降低；而且转基因烟草的叶绿体超微结构也发生了很大的变化，叶绿体比野生型小，基粒类囊体的垛叠少。但是，转基因烟草的生长、发育不受影响。转基因烟草的成熟、衰老叶的表型逐渐消失，叶绿素含量和PSⅡ的最大光化学效率也趋于正常，可能是在成熟衰老叶中有其它的补偿途径。因此，FeSOD在叶绿体发育的早期起作用。我们试验中所用的材料均为烟草的幼叶。
2.转基因烟草对光氧化胁迫敏感，将转基因烟草移至弱光下生长，它们的表型可以恢复。100μmol m-2 s-1光强下生长的烟草的O2-原位检测结果表明，转基因烟草体内的O2-含量显著升高，而弱光下生长的转基因烟草体内的O2-不产生积累，转基因烟草体内的H2O2含量与野生型相比无显著差异。因此，转基因烟草在100μmol m-2s-1光强下的表型与体内显著升高的O2-含量相关。
3.SOD是活性氧清除的第一道防线，它催化O2-的歧化反应生成H2O2。在叶绿体里，H2O2主要被APX所清除，APX需要和抗坏血酸-谷胱甘肽循环的酶协同作用清除H2O2。抗坏血酸-谷胱甘肽循环包括以下四种酶：APX、DHAR、MDHAR和GR。我们对转基因烟草和野生型的上述抗氧化酶进行了测定，结果表明转基因烟草的SOD、APX、MDAHR、DHAR和GR的活性均上调。转基因烟草的ASC和GSH的还原态ASC/DHA、GSH/GSSG没有下降。因此，转基因烟草的抗氧化系统发生了改变，表现为抗氧化酶的上调，通过抗氧化酶的上调维持抗氧化物的还原态。抗氧化酶的上调被认为是转基因烟草对FeSOD缺陷的补偿。
4.转基因烟草的Fv/Fm、ΦPSⅡ、PSⅡ的电子传递链活性均显著降低，免疫印迹分析表明转基因烟草的PSⅡ核心蛋白D1、D2、CP47和CP43显著下降。以上结果表明在100μmol m-2s-1的光强下，转基因烟草的PSⅡ严重受损。P700、PSⅠ的电子传递活性及PSⅠ的反应中心蛋白的免疫印迹结果表明，PSⅠ受到的损伤小于PSⅡ。使用叶绿素荧光衰减和热致发光对转基因烟草PSⅡ的伤害进行进一步研究，结果表明转基因烟草PSⅡ的受体侧发生很大的改变，QA到QB的电子传递受阻，QA与放氧复合体的逆向电子传递与电荷重组不受影响，PSⅡ的供体侧没有发生改变。
5.最后，对转基因烟草对光氧化胁迫高度敏感的机理进行了探讨。将添加或不加叶绿体蛋白合成抑制剂lincomycin的烟草叶片进行光抑制，将光破坏和修复过程分开，发现转基因烟草的光破坏加强，PSⅡ核心蛋白的降解加快导致PSⅡ的稳定性降低，而转基因烟草的修复过程不受影响。
总体来说，转基因烟草体内增加的O2-导致其光破坏加强，PSⅡ的稳定性降低，使得转基因烟草对光氧化敏感，PSⅡ严重受损。