【摘 要】
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目的:分离培养、鉴定骨髓间充质干细胞(MSCs).用不同浓度的5-氮杂胞苷(5-aza)和5-aza与培养心肌细胞的液体(CC)共同诱导MSCs分化成心肌样细胞(CGCs)以及将MSCs移植到体内心肌
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目的:分离培养、鉴定骨髓间充质干细胞(MSCs).用不同浓度的5-氮杂胞苷(5-aza)和5-aza与培养心肌细胞的液体(CC)共同诱导MSCs分化成心肌样细胞(CGCs)以及将MSCs移植到体内心肌组织微环境中观察其生长分化情况.方法:无菌条件下抽取Wister大鼠股骨、胫骨骨髓,用密度为1.073的Percoll分离液离心分离,取含有MSCs的低密度血小板层细胞进行体外培养和连续传代.倒置相差显微镜、电镜观察细胞形态;免疫细胞化学法鉴定MSCs细胞膜抗原特性;酶细胞化学法测定骨源性碱性磷酸酶(ALP)活性.取第3代MSCs,体外实验:用不同浓度的5-aza和不同浓度的5-aza与CC共同诱导分化,采用HE染色、心肌特异性肌钙蛋白I(cTnI)免疫组化染色以及透射电镜观察.体内实验:将MSCs用BrdU进行标记后注入到大鼠左心室前壁的心肌组织微环境中.分析各实验组MSCs生长分化情况.结果:1.MSCs的分离、培养:Percoll分离液分离得到的单个核细胞为MSCs,取第三代MSCs进行表面标记物检测鉴定,结果显示:CD<,14>、CD<,34>、ALP表达阴性,CD<,29>、CD<,44>、波形蛋白(Vimentin)荧光染色表达阳性;透射电镜示MSCs处于活动期状态.2.定向诱导成心肌样细胞:体外组加入3 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L三个浓度5-aza以及加入CC进行诱导,倒置显微镜下显示:细胞形态逐渐发生向心肌样细胞分化.取10天、20天、28天3个时间点,随机选取10个视野,观察cTnI阳性细胞数,进行统计学分析,结果显示:28天左右在10μmol/L5-aza+CC组中cTnI阳性细胞最多.电镜示诱导后的MSCs有肌丝出现,细胞核呈单核、椭圆形,位于细胞的中央,细胞中可见到丰富的线粒体和糖原颗粒.体内组:注入MSCs后在心肌损伤区观察到BrdU免疫组化阳性细胞.结论:1.从大鼠骨髓中分离出的细胞经过鉴定被证实是MSCs.2.在含有5-aZa的诱导液中MSCs可以诱导分化成CGCs,10μmol/L5-aza是其最佳的诱导浓度.3.加入CC后,MSCs向CGCs的转化率增高.4.将MSCs植入同种异体的成年大鼠心肌疤痕组织中能够继续增殖并具有修复疤痕组织的功能.
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