论文部分内容阅读
本研究分为三部分：
第一部分：帕金森病大鼠动物模型的构建。
研究目的：构建稳定可靠、成功率高的帕金森病大鼠模型。
研究方法：在大鼠脑立体定位仪上用0.2％6-羟基多巴胺(6-Hydroxydopamine，6-OHDA)注射至成年Sprague-Dawley(SD)大鼠右侧前脑内侧束(medialforebrainbundle，MFB)，然后应用阿朴吗啡(Apomorphine，APO)诱发旋转，进行行为学观察，并灌注、切片进行Nissl染色、多巴胺能神经元标志物酪氨酸羟化酶(TyrosineHydroxylase，TH)的免疫组织化学检测。
研究结果：PD模型鼠出现典型的旋转行为，旋转速度超过210圈/30分钟的占全部实验动物的67％，连续观察20周旋转速度并不随时间推移而下降Nissl染色见损毁侧黑质致密部神经元数量锐减；TH免疫组化染色见损毁侧黑质致密部TH免疫阳性(TH-immunoreactivity，TH-IR)细胞大部分消失，约为正常侧的11％，部分残留TH阳性神经元胞核固缩，胞体明显肿胀或空泡变；损毁侧纹状体内多巴胺(dopamine，DA)神经元末梢的TH反应性降低，TH免疫阳性纤维较正常侧明显减少。
研究结论：6-OHDA注射MFB构建PD模型稳定可靠、成功率高。
第二部分：去多巴胺神经纹状体提取液诱导人胚神经干细胞向多巴胺神经元的定向分化。
研究目的：探讨去多巴胺神经纹状体提取液诱导人胚神经干细胞向多巴胺神经元的定向分化作用。
研究方法：采用无血清培养和单细胞克隆技术，从3-4月龄人胚皮质和中脑组织中分离、克隆人神经干细胞，然后扩增获得大量来源于同一细胞亚细胞系的人神经干细胞克隆球。部分神经球进行5-溴-2-脱氧尿苷(5-Bromo-2-deoxy-Uridine，BrdU)标记及其免疫荧光检测和神经上皮干细胞蛋白(NeuroepithelialStemProteins，Nestin)免疫荧光检测；另一部分神经球用含有10％胎牛血清的培养液诱导分化，3周后分别进行星形胶质细胞和少突胶质细胞特异性标记物胶质纤维酸性蛋白(GlialFibrillaryAcidicProtein，GFAP)和2,3-环核苷酸磷酸二酯酶的免疫荧光检测。分别取成功PD大鼠模型的损毁侧(右侧)纹状体和未损毁侧(左侧)纹状体制备成提取液。取6块24孔培养板的132个孔接种人胚神经干细胞克隆球，分成12组(皮质、中脑各6组)，每组11孔，加入不同的分化培养液：对照组加入含10％胎牛血清(FetalBovineSerum，FBS)的分化培养液；损毁侧纹状体提取液组加入含损毁侧纹状体提取液的10％FBS分化培养液；未损毁侧纹状体提取液组加入含未损毁侧纹状体提取液的10％FBS分化培养液；IL-1α组加入含白细胞介素-1α(Interleukin-1α，IL-1α)的10％FBS分化培养液；联合因子组加入含IL-1α+白细胞介素11(Interleukin-11，IL-11)+白血病抑制因子(1eukemiainhibitoryfactor，LIF)+胶质细胞源性神经营养因子(GlialCellDerivedNeurotrophicFactor，GDNF)的10％FBS分化培养液；损毁侧纹状体提取液+联合因子组加入含损毁侧纹状体提取液和联合因子的10％FBS分化培养液。在饱和湿度的37℃、5％CO2培养箱中分化3周后，用免疫荧光检测各组分化细胞中多巴胺神经元特异性标志物酪氨酸羟化酶(TyrosineHydroxylase，TH)的-3-表达，应用图象处理系统对TH阳性神经元的数量、胞体面积和细胞周长进行图象处理。用STATA8.0统计软件进行方差分析和两两比较。
研究结果：皮质和中脑细胞悬液培养2周后可形成由数百个细胞组成的呈悬浮生长的神经球，经BrdU和Nestin免疫荧光检测均呈阳性。诱导分化后可见呈GFAP和CNP阳性的细胞。中脑未损毁侧纹状体提取液组TH阳性神经元数为9.03±1.35个/视野，分化率为5.64±0.09％，胞体面积为316.30±5.53μm2，细胞周长为137.54±3.98μm；皮质IL-1α组TH阳性神经元数为7.28±0.48个/视野，分化率为6.29±0.12％，胞体面积为317.37±6.35μm2，细胞周长为137.56±5.18μm；中脑IL-1α组TH阳性神经元数为12.53±1.87个/视野，分化率为7.86±0.13％，胞体面积为317.72±4.52μm2，细胞周长为145.49±5.01μm；皮质联合因子组TH阳性神经元数为14.64±1.67个/视野，分化率为8.08±0.16％，胞体面积为367.52±8.83μm，细胞周长为176.73±6.80μm；中脑联合因子组TH阳性神经元数为15.46±1.28个/视野，分化率为8.58±0.09％，胞体面积为374.74±8.80μm2，细胞周长为206.58±6.89μm；皮质损毁侧纹状体提取液+联合因子组TH阳性神经元数为16.91±1.94个/视野，分化率为-4-9.34±0.15％，胞体面积为373.52±7.49μm2，细胞周长为186.96±4.86μm；中脑损毁侧纹状体提取液+联合因子组TH阳性神经元数为20.17±1.75个/视野，分化率为10.57±0.24％，胞体面积为399.84±9.27μm2，细胞周长为226.29±6.28μm。中脑各组TH阳性神经元数由多至少依次为：损毁侧纹状体提取液+联合因子组、损毁侧纹状体提取液组与联合因子组(之间差异无显著性)、IL-1α组、未损毁侧纹状体提取液组和对照组。皮质各组TH阳性神经元胞体面积由大至小依次为：损毁侧纹状体提取液+联合因子组、联合因子组、损毁侧纹状体提取液组、IL-1α组与未损毁侧纹状体提取液组(之间差异无显著性)和对照组；中脑各组TH阳性神经元胞体面积由大至小依次为：损毁侧纹状体提取液+联合因子组、联合因子组与损毁侧纹状体提取液组(之间差异无显著性)、IL-1α组与未损毁侧纹状体提取液组(之间差异无显著性)和对照组。皮质各组TH阳性神经元细胞周长由大至小依次为：损毁侧纹状体提取液+联合因子组、联合因子组、损毁侧纹状体提取液组、IL-1α组、未损毁侧纹状体提取液组和对照组；中脑各组TH阳性神经元细胞周长由大至小依次为：损毁侧纹状体提取液+联合因子组、联合因子组、损毁侧纹状体提取液组、IL-1α组与未损毁侧纹状体提取液组(之间差异无显著性)和对照组。
研究结论：PD模型鼠损毁侧纹状体提取液对人神经干细胞向成熟的多巴胺能神经元分化有促进作用；联合应用损毁侧纹状体提取液和IL-1α、IL-11、LIF、GDNF等细胞因子对神经干细胞向成熟的多巴胺能神经元分化具有协同作用。
第三部分：神经干细胞移植治疗帕金森病的实验研究。
研究目的：观察人、鼠胚神经干细胞移植入PD模型大鼠MFB损毁侧(右侧)纹状体后存活、迁移和分化情况。
研究方法：将皮质、中脑来源的人或鼠胚神经干细胞先用Hoechst33342或BrdU标记，分别在加细胞因子(IL-1α+IL-11+LIF+GDNF)和不加细胞因子的情况下，移植至成功PD模型大鼠的损毁侧(右侧)纹状体中，然后应用APO诱发旋转，进行行为学观察，并灌注、切片进行Nissl染色和神经元特异性标志物MAP-2、胶质细胞特异性标志物GFAP和多巴胺能神经元特异性标志物TH的免疫荧光检测。用图象处理系统对TH阳性神经元进行计数，STATA8.0软件进行统计学处理。
研究结果：移植加因子的鼠胚中脑神经干细胞后，PD模型鼠的旋转次数明显减少；移植鼠胚中脑神经干细胞和加因子的人胚中脑神经干细胞后PD模型鼠的旋转行为有所改善；而移植鼠胚不加因子与加因子的皮质神经干细胞、移植人胚不加因子与加因子的皮质神经干细胞以及移植人胚中脑神经干细胞后，PD模型鼠的旋转行为均没有明显改善。移植人胚神经干细胞后，在移植区、同侧皮质、同侧胼胝体甚至对侧胼胝体都发现了Hoechst33342阳性细胞；并且在移植区附近检测到了少量Hoechst33342与MAP-2免疫荧光双标阳性细胞和大量Hoechst33342与GFAP免疫荧光双标阳性细胞。在移植人胚的神经干细胞中，假手术组未见到BrdU或TH阳性细胞；皮质组可见BrdU阳性细胞，但基本未见TH阳性细胞和BrdU/TH双标神经元；皮质因子组偶见双标神经元；中脑组可见极少双标神经元，且TH多集中在胞体内表达；中脑因子组可见少量双标神经元，除胞体外，突起中也有少量表达。人、鼠不同来源的神经干细胞移植后BrdU与TH双标神经元数比较发现：除皮质因子组之间差异无显著性，皮质组、中脑组和中脑因子组两种来源间的差异均有显著性。
研究结论：移植至PD模型鼠去多巴胺能神经支配纹状体中的人、鼠神经干细胞能够长期存活并向移植区周围迁移，较多地分化为星形神经胶质细胞，较少地分化为神经元，其中一小部分分化成了多巴胺能神经元；移植至PD模型鼠去多巴胺能神经支配纹状体中的人、鼠中脑来源的神经干细胞较皮质来源的神经干细胞更易分化为多巴胺能神经元；神经干细胞与IL-1α、IL-11、LIF、GDNF等细胞因子一起移植至PD模型鼠去多巴胺能神经支配纹状体中，能较明显地改善PD模型鼠的旋转行为，并能增加神经干细胞分化为多巴胺能神经元的数量。