论文部分内容阅读
目的：观察12、20、28周龄OPG基因敲除小鼠椎间盘退变情况，研究中药复方健腰密骨片及其有效组分对OPG基因敲除小鼠椎间盘退变的影响，探讨其作用环节和作用机制。
方法：
1. OPG基因敲除小鼠椎间盘退变的研究
通过杂交繁殖，获得12、20、28周龄OPG基因敲除小鼠(Knock out mice，KO mice)和同窝出生野生型小鼠(Wild type mice，WT mice)。取12、20、28周龄OPG-/-小鼠和WT小鼠(每组10只)的颈椎，分别进行大体形态学染色，TRAP染色检测破骨细胞，免疫组化染色观察成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞的相关指标，TUNEL染色观察凋亡，real-timeRT-PCR分析相关指标表达。
2.健腰密骨片及其有效组分对OPG基因敲除小鼠椎间盘退变的影响
将12周龄OPG基因敲除小鼠随机分为空白对照组、健腰密骨片组、蛇床子素组、淫羊藿苷组、补骨脂素组、固邦组，以12周龄WT小鼠做为正常对照，每组10只，含药饲料给药3月后，取下各组小鼠的颈椎。分别进行甲苯胺兰、TRAP、免疫组化染色以及real-timeRT-PCR分析。
结果：
1. OPG基因敲除小鼠椎间盘退变的研究
形态学染色显示在20周龄OPG-/-小鼠椎间盘软骨终板部位出现缺损和骨化，28周龄时更加严重；免疫组化染色发现椎间盘内Ⅱ型胶原表达降低，Ⅰ型、Ⅹ型胶原、Catepthin K、IL-1β和TNFα表达增加；TRAP染色观察到OPG基因敲除小鼠的软骨终板部位出现大量的破骨细胞，且数目随年龄增加；TUNEL染色观察到在28周龄OPG基因敲除小鼠的椎间盘出现大量的凋亡细胞。实时定量RT-PCR分析发现OPG-小鼠椎间盘组织Col10α1、MMP13、ALP、osteocalcin、osterix、Col1α1、BMP2、BMP7、MMP9、RANK、Cathepsin K、TRAPmRNA表达明显增加，而Co12α1和aggrecanmRNA表达显著降低。OPG基因敲除小鼠随着增龄椎间盘在20周龄时观察到退变现象，28周龄时更加明显。
2.健腰密骨片及其有效组分对OPG基因敲除小鼠椎间盘退变的影响
与空白对照组相比，蛇床子素干预后形态学染色发现软骨终板部位骨化和缺损加重。免疫组化染色Ⅹ型胶原蛋白表达增加，椎间盘组织aggrecanmRNA的水平降低，Col1 al、Col10al、MMP13mRNA水平增高；补骨脂素组软骨终板部位骨化和缺损加重，免疫组化染色Ⅱ、Ⅹ型胶原蛋白的表达增加，Ⅰ型胶原蛋白的表达减少，TRAP染色仍有阳性染色，Cathepsin K免疫组化染色表达增加，椎间盘组织aggrecan mRNA的表达降低，Col1 al、MMP13、Col10al mRNA的表达增加；淫羊藿苷组软骨终板部位骨化和缺损减少，免疫组化染色发现Ⅱ型胶原蛋白的表达增加，Ⅰ型胶原蛋白的表达减少，TRAP染色显示破骨细胞数量明显减少，且Cathepsin K蛋白表达减少。相应基因水平研究发现淫羊藿苷可以降低Col lal和MMP13 mRNA的表达，Col10al mRNA的表达增加，对破骨细胞的相关基因MMP9和Cathepsin K mRNA有下调作用；健腰密骨片组形态学染色发现椎间盘上出现的骨化和缺损减少，免疫组化染色发现Ⅱ型胶原蛋白的表达升高，Ⅹ、Ⅰ型胶原蛋白的表达降低，TRAP染色阳性染色减少，Col1 al、MMP13、aggrecan mRNA的表达增加，Col10 al mRNA的表达降低；固邦组椎间盘上出现的骨化和缺损减少，免疫组化染色发现Ⅰ型胶原蛋白的表达降低，TRAP染色阳性染色减少，Cathepsin K表达减少。aggrecan、Col1 al、Col10 al、MMP13 mRNA的表达增加。可见，蛇床子素、补骨脂素对OPG基因敲除小鼠的椎间盘退变未能取得良好的疗效，淫羊藿苷和健腰密骨片对OPG基因敲除小鼠的椎间盘有保护作用，固邦作用尚不确切。
结论：
1. OPG基因的缺乏导致破骨细胞/破软骨细胞的活化，主要通过破骨细胞介导的软骨吸收的增加，引起椎间盘软骨终板的改变。并刺激成骨细胞在软骨终板缺损部位出现并成骨，而这种作用会进一步影响到椎间盘，从而导致椎间盘退变。OPG在椎间盘水平的变化可能是椎间盘退变性疾病一个新的机制。
2.蛇床子素和补骨脂素对于OPG基因敲除小鼠的椎间盘退变未能取得良好的疗效，此二者主要具有促进成骨的作用，而对OPG基因敲除后产生的破骨细胞不能起抑制作用。这提示在OPG缺乏的情况下，不适宜单独使用蛇床子素或补骨脂素治疗因OPG缺乏引起的椎间盘退变。淫羊藿苷对OPG基因敲除小鼠椎间盘上的破骨细胞具有抑制作用，同时降低了成骨的表达和软骨的吸收，防止软骨基质的降解，对于OPG基因敲除引起的椎间盘退变具有保护作用。因此对于因OPG缺乏引起的椎间盘退变可以应用该药。健腰密骨片的主要作用在于干预软骨细胞，促进成骨作用。破骨细胞数量减少，但是破骨细胞的相关基因表达没有影响，可能是由于其他药物的协同作用所致。因此对于OPG缺乏引起的椎间盘退变，复方的组方应进一步优化。