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前言：
随着生活水平的提高,人们越来越注意生活品质的提高。皮肤是人体最大的器官,皮肤的状况是直接影响个体日常生活和心理满足的重要因素之一,保持皮肤活性与美感、减慢皮肤老化过程不但可以帮助我们保持年轻的容貌,而且对我们的机体也会产生很大益处,因此,皮肤老化及其机制的研究成为医学及生物学领域的热点。
皮肤的老化包括内源性老化与外源性老化。外源性老化主要由紫外线引起。紫外线辐射对人类的作用具有两面性:紫外线可以杀死皮肤表面的病原微生物、诱导维生素D的合成,并能够治疗某些皮肤病如:寻常型银屑病、角化性湿疹、白癜风等:紫外线辐射对皮肤的害处包括:免疫抑制,光老化及诱导皮肤癌的发生。到达地球表面的日光光谱中含有紫外线、可见光以及红外光等波段。紫外线波长短于可见光,其波长范围为200-400nm。根据紫外线的生物学作用的细微不同,进一步将其分为三个部分:紫外线A(320-400nm)、紫外线B(280-320nm)、紫外线C(200-280nm)。紫外线C被臭气层有效阻挡而不能到达地球表面,紫外线A和紫外线B辐射均可以到达地球表面,且数量足以对皮肤产生重要的生物学效应。
目前认为紫外线致细胞老化的分子机制主要包括:光老化的端粒机制,代谢途径与信号途径相互用机制,IFN信号途径作用机制等。
IFI16(interferoninducibleprotein16,干扰素诱导蛋白16)是干扰素诱导核蛋白,编码IFI16的基因位于1q22;人成纤维细胞中,IFI16表达水平升高导致细胞老化:老化成纤维细胞中IFI16mRNA水平高于年轻成纤维细胞;在正常成纤维细胞中IFI16蛋白表达增加与细胞老化相关的细胞生长停滞相关;在永生化的成纤维细胞中过度表达IFI16能够强烈抑制细胞增殖并启始细胞老化过程。
端粒酶-端粒在细胞老化中起着关键性作用的,且该机制也参与光老化过程。参与调节hTERT基因表达的几条信号通路中,负性调节信号途径中包括由IFI16介导的IFN-信号通路,这是一条新的调节hTERT的通路。
本研究以人皮肤成纤维细胞研究对象,首先建立UVB诱导的细胞老化模型,并检测IFI16、hTERT和p53表达水平的变化;通过siRNA技术,降低IFI16的表达,从而观察IFI16表达水平的改变其对hTERT和p53表达水平的影响,以确定IFI16是否参与UVB诱导的提前老化,以及IFI16在该过程中是否通过调节端粒-端粒酶活性而起作用。
材料和方法：
一、研究对象
人原代包皮成纤维细胞
二、实验材料
DMEM培养基,胎牛血清,双抗(青链霉素),EDTA,胰蛋白酶,CCK-8试剂,SA-β-gal染色试剂盒,细胞周期检测试剂盒,IFI16单克隆抗体,鼠抗人β-aetin单抗,h-TERT单克隆抗,p53单抗,BCA蛋白浓度测定试剂盒,组织总蛋白提取试剂盒,DNA提取试剂盒,Trizol,cDNA第一链合成试剂盒,PCR扩增试剂盒,siRNA,Transfect转染试剂。
三、实验方法
1、细胞分为两组,一组为对照组,另一组为UVB处理组;实验组细胞在一天内接受三次剂量为100mJ/cm2UVB照射,总照射剂量为300mJ/cm2。照射完成后,行老化相关β-半乳糖苷酶染色,并做细胞周期分析以证实细胞光化模型的成功建立。
2、细胞分为两组,一组为对照组,另一组为UVB处理组。按实验一方法建立细胞老化模型,用实时定量PCR方法检测并对比两组细胞的端粒长度;并用逆转录实时定量PCR及蛋白印迹(WB)方法在mRNA及蛋白水平检测、对比两组细胞IFI16、hTERT和p53表达水平;
3、细胞分6组,第一组为对照细胞,第二组为UVB照射细胞,第三组为对照siRNA转染组,第四组为IFI16siRNA转染细胞,第五组为UVB+对照siRNA处理细胞,第六组为UVB+IFI16siRNA细胞。经过上述处理后,检测并对比各组细胞的端粒长度及hTERT和p53蛋白表达水平的变化。
四、统计学分析
相应数据用SPSS12.0统计包进行分析,两样本均数比较用t检验,多样本均数比较用方差分析,以p＜0.05有统计学意义。
结果：
1、100mJ/cm2UVB重复照射三次后,老化相关β-半乳糖苷酶染色显著升高(p＜0.05),细胞周期停滞于G2/M期;
2、100mJ/cm2UVB重复照射三次后,IFI16、hTERT在mRNA和蛋白水平表达升高(p＜0.05);p53在mRNA和蛋白水平毒达降低(p＜0.05);
3、100mJ/cm2UVB重复照射三次后,端粒长度缩短(p＜0.05);
4、未照射细胞与诱导老化细胞中,敲低IFI16表达后,端粒长度相比无显著变化;
5、正常细胞中,敲低IFI16表达后,hTERT和p53表达降低;
6、UVB诱导老化细胞中,敲低IFI16表达,hTERT和p53表达未见明显改变。
结论：
1、亚细胞毒性UVB重复照射人皮肤成纤维细胞可以诱导人皮肤成纤维细胞老化;
2、IFI16、hTERT和p53参与UVB诱导的老化皮肤成纤维细胞这一生物学过程;
3、UVB诱导的老化皮肤成纤维细胞中,端粒长度缩短;
4、正常对照成纤维细胞中,IFI16可以调节hTERT和p53的表达;
5、在UVB诱导人皮肤成纤维细胞老化过程中,IFI16表达水平降低不影响hTERT和p53的表达;
6、UVB诱导的细胞提前老化可能由IFI16-E2F信号途径或端粒-p53-端粒酶途径介导。