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目的:1.观察多西环素(DOX)在实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)大鼠发病过程中的防治作用;2.探讨DOX对防治EAE大鼠发病可能的免疫学机制。方法:随机将50只雌性Wistar大鼠分为正常对照组、EAE对照组、大剂量DOX防治组、中剂量DOX防治组、小剂量DOX防治组5组,每组10只。采用粗制髓鞘碱性蛋白(MBP)和含卡介苗(BCG)的完全福氏佐剂(CFA)制成免疫抗原,皮下注入EAE对照组及大、中、小剂量DOX防治组大鼠后足掌,同法给正常对照组大鼠注射等量生理盐水(NS)。自造模前三天起,分别给予大、中、小剂量DOX防治组大鼠DOX20mg/kg/d、10mg/kg/d、5mg/kg/d腹腔注射,正常对照组及EAE对照组大鼠予以等量NS腹腔注射,均连续10天。将发病大鼠连续3天神经功能障碍评分无加重、四肢瘫痪或死亡时作为发病高峰期。观察大鼠发病情况,并记录发病潜伏期和进展期以及高峰期神经功能障碍评分。在大鼠发病高峰期终止实验,处死大鼠,未发病大鼠及正常对照组大鼠4周后处死,并留取眶静脉血、脑脊液(CSF)、脑脊髓组织、脾脏组织。将脑脊髓组织行HE染色并在光镜下观察其病理学改变及程度;用酶联免疫吸附(ELISA)法检测大鼠发病高峰期外周血单个核细胞(PBMC)分泌IL-4、IL-17、IL-23、IFN-γ、TGF-β1水平及脑组织匀浆MMP-2、MMP-9水平;流式细胞仪测定脾脏Th17、CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞亚群分布比率;测定血清和CSF白蛋白含量,计算CSF和血清白蛋白含量比值即QA值,评估血脑屏障(BBB)功能。所获得的数据通过SPSS19.0软件包进行统计学分析。结果:(1)大鼠发病情况:正常对照组大鼠未见异常。eae对照组及大、中、小剂量dox防治组发病率分别为90%、40%、60%、80%。eae对照组及大、中、小剂量dox防治组发病潜伏期分别为11.3±1.5天、23.7±1.9天、20.6±1.2天、17.7±1.0天,各剂量dox防治组发病潜伏期均较eae对照组延长(p<0.01),大剂量dox防治组大鼠发病潜伏期延长最明显,各剂量dox防治组间差异有统计学意义(p<0.01)。eae对照组及大、中、小剂量dox防治组发病进展期分别为10.1±1.0天、4.4±0.6天、6.9±0.4天、7.7±0.7天,各剂量dox防治组发病进展期均较eae对照组缩短(p<0.01),其中以大剂量组大鼠发病进展期缩短最明显,各剂量dox防治组间差异有统计学意义(p<0.01或p<0.05)。eae对照组及大、中、小剂量dox防治组大鼠发病高峰期神经功能障碍评分分别为4.3±0.7分、1.1±0.4分、1.9±0.3分、3.0±0.3分,各剂量dox防治组神经功能障碍评分均较eae对照组降低(p<0.01),其中以大剂量组降低最明显,各剂量dox防治组间差异有统计学意义(p<0.01)。(2)病理学改变:正常对照组大鼠脑脊髓组织未见明显异常。eae对照组大鼠脑脊髓组织内可见小血管周围以淋巴细胞为主的大量炎性细胞浸润,并伴少许单核细胞,典型者形成“血管套”样改变。而各剂量dox防治组病理改变均较eae对照组减轻,其中以大剂量dox防治组最轻。(3)dox对eae大鼠发病高峰期pbmc分泌ifn-γ、il-4水平及ifn-γ/il-4比值的影响:eae对照组和各剂量dox防治组大鼠发病高峰期pbmc分泌ifn-γ水平、ifn-γ/il-4比值较正常对照组升高,eae对照组和中小剂量dox防治组大鼠发病高峰期pbmc分泌il-4水平较正常组降低(p<0.01),大剂量组ifn-γ水平较正常对照组改变不明显(p>0.05);各剂量dox防治组大鼠pbmc分泌ifn-γ水平、ifn-γ/il-4比值较eae对照组降低、il-4水平较eae对照组升高(p<0.01);随dox剂量增加,各剂量dox防治组大鼠pbmc分泌ifn-γ水平及ifn-γ/il-4比值越低、il-4水平越高,除大剂量dox防治组大鼠pbmc分泌il-4水平较中剂量组改变不明显外(p>0.05),余各组间差异有统计学意义(p<0.01)。(4)dox对eae大鼠发病高峰期pbmc分泌il-17、il-23、tgf-β1水平的影响:除大剂量dox防治组pbmc分泌il-17、il-23水平较正常对照组升高不明显(p>0.05)外,eae对照组和各剂量dox防治组大鼠发病高峰期pbmc分泌il-17、il-23水平较正常对照组升高,tgf-β1水平较正常对照组降低(p<0.01);各剂量dox防治组大鼠pbmc分泌il-17、il-23水平较eae对照组降低、tgf-β1水平较eae对照组升高(p<0.01);随dox剂量增加,各剂量dox防治组大鼠pbmc分泌il-17、il-23水平越低、tgf-β1水平越高,除大剂量dox防治组大鼠pbmc分泌tgf-β1水平较中剂量组改变不明显外(p<0.05),余各组间差异有统计学意义(p<0.01)。(5)dox对eae大鼠发病高峰期脾脏th17、cd4+cd25+foxp3+treg细胞亚群分布比率的影响:eae对照组和中、小剂量dox防治组大鼠发病高峰期脾脏th17细胞比率较正常对照组升高,脾脏cd4+cd25+foxp3+treg细胞比率较正常对照组降低(p<0.01),大剂量dox防治组大鼠发病高峰期脾脏th17细胞、cd4+cd25+foxp3+treg细胞比率较正常组改变不明显(p>0.05);各剂量dox防治组大鼠脾脏th17细胞比率较eae对照组降低、脾脏cd4+cd25+foxp3+treg细胞比率较eae对照组升高(p<0.01);随dox剂量增加,各剂量dox防治组大鼠脾脏th17细胞比率越低、cd4+cd25+foxp3+treg细胞比率越高,各剂量dox防治组间差异有统计学意义。(6)dox对eae大鼠发病高峰期脑组织mmp-2、mmp-9水平及qa值的影响:除大剂量dox防治组大鼠脑组织mmp-2水平较正常对照组升高不明显(p>0.05)外,eae对照组及各剂量dox防治组大鼠发病高峰期脑组织mmp-2、mmp-9水平及qa值较正常对照组明显升高(p<0.01或p<0.05),各剂量dox防治组大鼠发病高峰期脑组织mmp-2、mmp-9水平及qa值较eae对照组明显降低(p<0.01),随dox剂量增加,各剂量dox防治组大鼠脑组织mmp-2、mmp-9水平及qa值水平越低,各dox防治组间差异有统计学意义(p<0.01或p<0.05)。(7)相关性分析:eae对照组及各剂量dox防治组大鼠发病潜伏期与高峰期ifn-γ/il-4比值、il-17、mmp-2、mmp-9、qa值、th17细胞比率呈负相关(p<0.01或p<0.05),与发病高峰期tgf-β1、cd4+cd25+foxp3+treg细胞比率呈正相关;eae对照组及各剂量dox防治组大鼠发病进展期与高峰期ifn-γ/il-4比值、il-17、mmp-2、mmp-9、qa值、th17细胞比率呈正相关(p<0.01或p<0.05),与发病高峰期tgf-β1、cd4+cd25+foxp3+treg细胞比率呈负相关;eae对照组及各剂量dox防治组大鼠发病高峰期神经功能障碍评分与高峰期ifn-γ/il-4比值、il-17、mmp-2、mmp-9、qa值、th17细胞比率呈正相关(p<0.01或p<0.05),与发病高峰期tgf-β1、cd4+cd25+foxp3+treg细胞比率呈负相关。结论:1.在eae发病高峰期,大鼠外周血促炎因子增多、抑炎因子减少,脾脏th17比率增高、cd4+cd25+foxp3+treg细胞比率降低,存在体内th1/th2平衡及th17/cd4+cd25+foxp3+treg平衡漂移。2.在eae发病高峰期,大鼠脑组织MMP-2、MMP-9水平升高以及脑脊液和血清蛋白比值QA值升高,提示BBB破坏。3.DOX可降低EAE大鼠的发病率,延长EAE大鼠发病潜伏期、缩短进展期、降低发病高峰期神经功能障碍评分,减轻CNS炎症细胞浸润,提示DOX对EAE发病有防治作用。4.DOX通过抑制促炎性细胞因子的生成、促进抑炎性细胞因子的释放,降低脾脏Th17比率、升高CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比率,降低脑组织MMP-2、MMP-9水平及QA值,纠正Th1/Th2、Th17/CD4+CD25+Foxp3+Treg平衡失调,保护BBB,从而对EAE的发病起防治作用。