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鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis,DVH)是由鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)引起的一种急性、高度接触性传染病,主要侵害3周龄内雏鸭,死亡率可高达90％。病鸭表现为角弓反张,剖检可见肝脏肿大,表面树枝状充血或出血性斑点。本病最早报道于美国长岛。我国最早于1958年发生鸭病毒性肝炎疾病。鸭肝炎病毒分为三个血清型,分别为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型,其中Ⅰ型呈世界范围分布。三个血清型之间没有交叉保护作用。目前,Ⅰ型鸭肝炎已经成为危害全球养鸭业的主要疾病之一。
本研究将广东佛山地区分离到的1株Ⅰ型鸭肝炎病毒全基因组序列进行测定并分析。结果表明,不含poly(A)尾的DHv-Ⅰ基因组全长7690bp,只含有一个多聚蛋白(ORF),编码2249个氨基酸。将此株病毒株与GenBank公布的其他DHV全基因序列进行序列分析表明,VP1蛋白的变异最大,180～220位为高变区。与DHV-Ⅰ参考毒株核苷酸序列同源性在94.0～97.4%之间,氨基酸序列同源性在97.5～99.2%之间。遗传进化分析表明,此株鸭肝炎病毒与DHV-Ⅰ参考毒株处于同一分支,与韩国与台湾新型鸭肝炎病毒处于不同分支。
此外,本研究还构建了Ⅰ型鸭肝炎病毒感染性克隆。利用特异性引物分三段对Ⅰ型鸭肝炎病毒SS株进行扩增。在全基因组5’端引入T7启动子核心序列,3’端引入含有20个A碱基的ploy(A)尾以及线性化酶切位点,并且在基因组第1061位引入沉默突变以区别亲本毒和拯救毒。将三个片段依次连入低拷贝载体pOK12,经过酶切鉴定和DNA序列测定,成功构建了SS株的全长cDNA克隆pOKABC。将病毒的全长cDNA克隆pOKABC大量培养后,按低拷贝质粒提取方法提取质粒,用限制性内切酶AclI线性化后,作为体外转录模板。转录出的RNA用DNaseI消化模板质粒DNA,再经脂质体DMRIE-C转染BHK-21细胞,转染后48h的细胞上清接种无特异病原体鸡胚,48h内第一代接种病毒鸡胚死亡。经RT-PCR、间接免疫荧光鉴定和分子标签鉴定等证实获得了有感染性的拯救病毒,通过鸡胚半数致死量实验证明拯救毒与亲本毒对胚体的致病力相仿。本文的研究结果为在分子水平上研究DHV-Ⅰ的复制和致病机理,基因结构和功能等提供技术手段,并为构建新型的病毒载体和发展安全有效的活病毒疫苗奠定基础。