论文部分内容阅读
研究背景
卵巢癌是病死率最高的妇科恶性肿瘤，而早期诊断技术以及长期有效的治疗方案的缺乏是卵巢癌病死率居高不下的原因。因此，寻找新的肿瘤标记物和治疗靶标一直以来都是卵巢癌研究领域的热点。
长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类长度大于200nt、不具备蛋白编码功能的RNA。与miRNA等小分子非编码RNA相比，lncRNA近几年才开始受到关注。然而，已有越来越多的研究显示lncRNA能够在染色质修饰、转录或转录后等水平调控下游基因的表达，进而参与细胞增殖、凋亡及侵袭等多种生物学过程并与肿瘤等疾病的发生发展相关。近年来，基因芯片和高通量测序技术在lncRNA的研究中发挥了重要作用。
Matastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1 (MALAT1)是一个长约8，000nt的非编码RNA，在正常人体组织中普遍表达。2003年，Ji等首次报道MALAT1在非小细胞肺癌中表达上调，并与患者的预后相关。此后，MALAT1又被证实与肝癌、宫颈癌、膀胱癌及胆囊癌等肿瘤的进展相关。然而，其在卵巢癌中的作用尚无研究涉及。
本研究分为两个部分。在第一部分中，我们利用基因芯片比较了具有不同侵袭潜能的卵巢癌细胞系的lncRNA表达谱，证实了lncRNA在具有不同侵袭潜能的卵巢癌细胞系中存在差异表达。在第二部分中，我们检测了MALAT1表达下调对卵巢癌细胞生物学行为的影响，发现MALAT1表达下调能够明显抑制卵巢癌细胞的增殖和转移，且MALAT1表达下调可导致多个与细胞增殖、转移和／或凋亡等生物学过程相关的基因的差异表达。
第一部分 长链非编码RNA在具有不同侵袭潜能的卵巢癌细胞系中表达谱的变化
目的
比较具有不同侵袭潜能的卵巢癌细胞系的lncRNA表达谱，筛选可能与卵巢癌转移相关的lncRNA，为后续研究奠定基础。
方法
1．Transwell侵袭实验验证人卵巢癌细胞系SKOV3及其亚系SKOV3.ip1的体外侵袭能力。
2．基因芯片检测两个细胞系lncRNA表达谱的差异。
3．选取9个差异表达的lncRNA进行qRT-PCR验证。
结果
1．与其母系细胞相比，SKOV3.ip1细胞的体外侵袭能力明显增强。
2．芯片共检出4，956个lncRNA，其中上调及下调2倍及以上的lncRNA分别有583个及578个。
3. 7个lncRNA的qRT-PCR结果与芯片结果相符。
结论
lncRNA在具有不同侵袭潜能的卵巢癌细胞系中存在差异表达，这一结果提示某些lncRNA可能在卵巢癌转移中发挥一定的作用，但其具体功能尚需进一步的研究证实。
第二部分 下调长链非编码RNA MALAT1的表达抑制卵巢癌细胞增殖和转移
目的
检测长链非编码RNA MALAT1在卵巢癌细胞中的表达情况，并进一步探索MALAT1在卵巢癌细胞增殖及转移中发挥的作用。
方法
1．用qRT-PCR检测人卵巢癌细胞株SKOV3和人正常卵巢上皮细胞HOSE中MALAT1的表达情况。
2．构建稳定低表达MALAT1的细胞株SKOV3-MALAT1-KD及其阴性对照SKOV3-NC。
3.细胞增殖实验和平板克隆形成实验检测MALAT1表达下调对卵巢癌细胞体外增殖能力的影响；细胞迁移和侵袭实验检测MALAT1表达下调对卵巢癌细胞体外迁移和侵袭能力的影响；流式细胞术检测MALAT1表达下调对卵巢癌细胞凋亡水平的影响。
4．将稳转细胞株SKOV3-MALAT1-KD及其阴性对照分别做裸鼠移植瘤模型，检测MALAT1表达下调对卵巢癌细胞体内成瘤能力的影响。
5．分别从SKOV3-MALAT1-KD和SKOV3-NC细胞中提取RNA用于基因表达谱芯片研究，比较两组细胞基因表达差异并从中选取20个差异表达的、与细胞增殖、转移和／或凋亡等生物学过程相关的基因进行qRT-PCR验证。
结果
1．qRT-PCR结果显示MALAT1在人卵巢癌细胞株中表达水平明显上调。
2．成功构建稳转细胞株SKOV3-MALAT1-KD和SKOV3-NC，干扰效果达77%。
3．细胞增殖实验和克隆形成实验证实MALAT1表达下调可显著地抑制卵巢癌细胞的体外增殖能力(P＜0.01)；迁移和侵袭实验证实MALAT1表达下调可显著地抑制卵巢癌细胞的体外迁移和侵袭能力(P＜0.01)；与其阴性对照相比，MALAT1表达下调的细胞凋亡水平显著升高(P＜0.01)。
4．体内实验结果显示SKOV3-MALATI-KD组移植瘤的体积明显小于阴性对照组的体积，差异具有统计学意义(P＜O.01)。
5．芯片结果显示MALAT1表达下调所导致的2倍以上差异表达的基因有921个；qRT-PCR结果显示其中19个基因确实存在差异表达。
结论
MALAT1表达下调能够在体外抑制卵巢癌细胞的增殖和转移。此外，MALAT1表达下调还能够抑制卵巢癌细胞的体内成瘤能力。MALAT1表达下调可导致多个与细胞增殖、转移及凋亡等生物学过程相关的基因的差异表达。我们的研究结果显示MALAT1对卵巢癌有促进作用，或许能够成为新的卵巢癌治疗靶点。
卵巢癌是病死率最高的妇科恶性肿瘤，而早期诊断技术以及长期有效的治疗方案的缺乏是卵巢癌病死率居高不下的原因。因此，寻找新的肿瘤标记物和治疗靶标一直以来都是卵巢癌研究领域的热点。
长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类长度大于200nt、不具备蛋白编码功能的RNA。与miRNA等小分子非编码RNA相比，lncRNA近几年才开始受到关注。然而，已有越来越多的研究显示lncRNA能够在染色质修饰、转录或转录后等水平调控下游基因的表达，进而参与细胞增殖、凋亡及侵袭等多种生物学过程并与肿瘤等疾病的发生发展相关。近年来，基因芯片和高通量测序技术在lncRNA的研究中发挥了重要作用。
Matastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1 (MALAT1)是一个长约8，000nt的非编码RNA，在正常人体组织中普遍表达。2003年，Ji等首次报道MALAT1在非小细胞肺癌中表达上调，并与患者的预后相关。此后，MALAT1又被证实与肝癌、宫颈癌、膀胱癌及胆囊癌等肿瘤的进展相关。然而，其在卵巢癌中的作用尚无研究涉及。
本研究分为两个部分。在第一部分中，我们利用基因芯片比较了具有不同侵袭潜能的卵巢癌细胞系的lncRNA表达谱，证实了lncRNA在具有不同侵袭潜能的卵巢癌细胞系中存在差异表达。在第二部分中，我们检测了MALAT1表达下调对卵巢癌细胞生物学行为的影响，发现MALAT1表达下调能够明显抑制卵巢癌细胞的增殖和转移，且MALAT1表达下调可导致多个与细胞增殖、转移和／或凋亡等生物学过程相关的基因的差异表达。
第一部分 长链非编码RNA在具有不同侵袭潜能的卵巢癌细胞系中表达谱的变化
目的
比较具有不同侵袭潜能的卵巢癌细胞系的lncRNA表达谱，筛选可能与卵巢癌转移相关的lncRNA，为后续研究奠定基础。
方法
1．Transwell侵袭实验验证人卵巢癌细胞系SKOV3及其亚系SKOV3.ip1的体外侵袭能力。
2．基因芯片检测两个细胞系lncRNA表达谱的差异。
3．选取9个差异表达的lncRNA进行qRT-PCR验证。
结果
1．与其母系细胞相比，SKOV3.ip1细胞的体外侵袭能力明显增强。
2．芯片共检出4，956个lncRNA，其中上调及下调2倍及以上的lncRNA分别有583个及578个。
3. 7个lncRNA的qRT-PCR结果与芯片结果相符。
结论
lncRNA在具有不同侵袭潜能的卵巢癌细胞系中存在差异表达，这一结果提示某些lncRNA可能在卵巢癌转移中发挥一定的作用，但其具体功能尚需进一步的研究证实。
第二部分 下调长链非编码RNA MALAT1的表达抑制卵巢癌细胞增殖和转移
目的
检测长链非编码RNA MALAT1在卵巢癌细胞中的表达情况，并进一步探索MALAT1在卵巢癌细胞增殖及转移中发挥的作用。
方法
1．用qRT-PCR检测人卵巢癌细胞株SKOV3和人正常卵巢上皮细胞HOSE中MALAT1的表达情况。
2．构建稳定低表达MALAT1的细胞株SKOV3-MALAT1-KD及其阴性对照SKOV3-NC。
3.细胞增殖实验和平板克隆形成实验检测MALAT1表达下调对卵巢癌细胞体外增殖能力的影响；细胞迁移和侵袭实验检测MALAT1表达下调对卵巢癌细胞体外迁移和侵袭能力的影响；流式细胞术检测MALAT1表达下调对卵巢癌细胞凋亡水平的影响。
4．将稳转细胞株SKOV3-MALAT1-KD及其阴性对照分别做裸鼠移植瘤模型，检测MALAT1表达下调对卵巢癌细胞体内成瘤能力的影响。
5．分别从SKOV3-MALAT1-KD和SKOV3-NC细胞中提取RNA用于基因表达谱芯片研究，比较两组细胞基因表达差异并从中选取20个差异表达的、与细胞增殖、转移和／或凋亡等生物学过程相关的基因进行qRT-PCR验证。
结果
1．qRT-PCR结果显示MALAT1在人卵巢癌细胞株中表达水平明显上调。
2．成功构建稳转细胞株SKOV3-MALAT1-KD和SKOV3-NC，干扰效果达77%。
3．细胞增殖实验和克隆形成实验证实MALAT1表达下调可显著地抑制卵巢癌细胞的体外增殖能力(P＜0.01)；迁移和侵袭实验证实MALAT1表达下调可显著地抑制卵巢癌细胞的体外迁移和侵袭能力(P＜0.01)；与其阴性对照相比，MALAT1表达下调的细胞凋亡水平显著升高(P＜0.01)。
4．体内实验结果显示SKOV3-MALATI-KD组移植瘤的体积明显小于阴性对照组的体积，差异具有统计学意义(P＜O.01)。
5．芯片结果显示MALAT1表达下调所导致的2倍以上差异表达的基因有921个；qRT-PCR结果显示其中19个基因确实存在差异表达。
结论
MALAT1表达下调能够在体外抑制卵巢癌细胞的增殖和转移。此外，MALAT1表达下调还能够抑制卵巢癌细胞的体内成瘤能力。MALAT1表达下调可导致多个与细胞增殖、转移及凋亡等生物学过程相关的基因的差异表达。我们的研究结果显示MALAT1对卵巢癌有促进作用，或许能够成为新的卵巢癌治疗靶点。