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研究背景
β-地中海贫血是一种对人类健康危害严重的遗传性溶血性贫血病,是因β-珠蛋白基因及其调控序列的点突变或缺失致使β-珠蛋白肽链合成减少或完全停止.β-地中海贫血的发病机制中有一类属于翻译缺陷型:突变或减少的编码序列引起的终止密码子,使得β-珠蛋白基因信使RNA合成中断,导致β-珠蛋白肽链无法正常合成,而发生β0地中海贫血,如移码突变CD41-42(-CTTT)突变和CD27/28(+C).这不仅使患者血红蛋白水平降低,而且使原来在数量上与之持平的α-珠蛋白肽链相对过剩,这些相对过剩的游离α-珠蛋白肽链并不能形成稳定的四聚体,它们沉积在红细胞中导致了大量无效红细胞生成和红细胞膜破坏而导致红细胞寿命缩短,而β-珠蛋白根本无法表达而引起了严重的溶血性贫血.近年来,新型病毒载体HIV慢病毒载体已经成功的运用到了β-地中海贫血的基因治疗中,尤其是剪接缺陷型β-地中海贫血,这类地中海贫血可以通过慢病毒介导RNA干扰可以使得例如内含子1(如IVS-I-110,IVS1-6,IVS1-5)或者内含子2的异常剪接(如IVS-Ⅱ-654,IVS-Ⅱ-745)的前体mRNA的剪接位点的异常表达的反义序列恢复,从而恢复正确的拼接序列,最终恢复血红蛋白的合成[1-7].
但是针对翻译缺陷型地中海贫血类型基因治疗的研究较少,这类型地中海贫血因为缺失片段大,现阶段无法通过RNA修复及干扰技术将其恢复正常碱基表达和肽链结构从而改善血红蛋白表达.所以只能通过导入正常人β蛋白基因补充或降低α-珠蛋白基因表达来调整α/β珠蛋白比例,但是α-珠蛋白基因干扰的有效率,β-珠蛋白基因及其调控片段的稳定表达的有效性,及α/β比例控制及协调的长期稳定性一直没有得到有效的印证.同时此类型的β重型地中海贫血基因敲除小鼠子代(th3/th3)常常死于妊娠后期,而使得该小鼠模型的研究一直受阻.
本课题在人红白血病细胞株K562细胞研究的基础上针对了广西最常见β-地中海贫血CD41-42突变型等翻译缺陷型地中海贫血类型,设计将2个慢病毒载体,即全长人β-珠蛋白基因慢病毒载体及α-珠蛋白基因干扰片段慢病毒载体,同时将2个慢病毒载体导入K562细胞以实现升高β-珠蛋白和降低α-珠蛋白表达来调整α/β珠蛋白比例的构想,为不同类型地中海贫血基因治疗提供更有效的证据及策略.同时对翻译突变型CD41-42型基因载体的设计及细胞模型的构建为进一步地中海贫血基因敲除小鼠模型及体内基因治疗的实施做好基础研究的准备.
研究目标
1.PCR扩增全长人β-珠蛋白基因,将目的基因片段和慢病毒载体连接,筛选获得慢病毒表达载体LV-β-globin(GFP),并进行测序验证.包装病毒,测定病毒浓度.
2.验证K562细胞上α-珠蛋白基因的mRNA表达情况,模拟β0地中海贫血的细胞模型.
3.设计及合成4个针对α-珠蛋白基因的RNAi慢病毒载体(RFP).将4个载体稳定转染K562细胞,real time PCR检测α-珠蛋白mRNA表达及干扰效率,筛选最有效的1个干扰片段用于后续实验.
4.将构建好的全长人β-珠蛋白基因慢病毒及α-珠蛋白基因RNAi慢病毒稳定转染K562细胞.检测α-珠蛋白及β-珠蛋白基因mRNA及蛋白表达,观察基因添加及干扰效果,以验证α/β珠蛋白比例调节使得β0型地中海贫血症状得到缓解的研究目的.
方法
1.提取人β-珠蛋白表达正常者的DNA,PCR扩增全长2l00bp人β-珠蛋白基因片段,加上SphI和NotI两个酶切位点进行T载体克隆,获得重组质粒pUC57-β-globin.用限制性内切酶,将目的基因片段和慢病毒载体pLVEFla/GFP+Puro连接,筛选获得慢病毒表达载体LV-β-globin,并进行测序验证.验证后将慢病毒载体转染293T细胞,包装病毒,测定病毒滴度.
2.将人慢性髓原白血病细胞K562细胞培养至对数增长期,选取人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MCF-7、人脑星形胶质母细胞瘤细胞U87作为对照组,进行α-珠蛋白基因(Hbα2) RNA检测,检测Hbα2含量.设计目的基因及内参基因GAPDH引物,real-time PCR检测α-珠蛋白基因mRNA(Hbα2)含量.
3.针对目的基因序列,利用RNA干扰序列设计原则,根据设计经验和设计软件评估,选择4个最佳的动力学参数RNA干扰靶点序列.分别命名为Hbα2-RNAi(1)，Hbα2-RNAi(2)，Hbα2-RNAi(3)，Hbα2-RNAi(4).合成含干扰序列的单链DNA oligo,退火配对产生双链,再通过其两端所含酶切位点AgeI和EcoRI直接连入酶切后的慢病毒载体骨架PGCSIL-017上;将连接产物转入制备好的感受态细胞,PCR鉴定阳性重组子后,送测序验证.
4.将人β-珠蛋白基因慢病毒LV-β-globin加入生长状态良好的K562细胞.感染3天后,观察感染效率及细胞荧光表达情况.在已经稳定转染了LV-β-globin的K562细胞接种到适宜密度后加入高MOI值筛选后的α-globin-RNAi慢病毒,感染3天后,观察感染效率及细胞荧光情况,运用流式细胞仪检测荧光效率.稳定转染后的K562细胞株,提取细胞总RNA,运用real-time PCR检测K562细胞中α-珠蛋白基因(Hbα2)及β-珠蛋白基因(HBB)mRNA表达情况.再运用western blotting检测α-珠蛋白及β-珠蛋白的蛋白表达情况.
结果
1.通过PCR获得长度为2128bp带有SphI和NotI序列的全长人β-珠蛋白基因.pUC57载体和慢病毒表达载体LV连接,慢病毒表达载体LV-β-globin构建成功,序列正确.提示成功构建包装含人正常β-珠蛋白基因的慢病毒载体.
2.结果显示Hbα2在K562中的表达丰度为高,在MCF-7,HEPG2中的表达丰度为中,在U87中的表达丰度为低.验证实验结果提示人慢性髓原白血病细胞K562细胞含有红系特性,高量表达α-珠蛋白基因(Hbα2)适宜作为本实验模型细胞,模拟β0表现的翻译缺陷型地中海贫血血液细胞.
3.显示连接入vshRNA片段的阳性克隆PCR片段大小为342bp,没有连接入vshRNA片段的空载体克隆PCR片段大小为307bp.测序结果经比对确认为正确的克隆.PCR验证结果及测序结果一致,对选择的4个慢病毒载体转染293T进行包装.4个α-globin-RNAi干扰载体的包装滴度分别为LV-Hbα2-RNAi(1)3 x108 TU/ml、LV-Hbα2-RNAi (2) 2x108TU/ml， LV-Hbα2- RNAi(3)2x108 TU/ml、LV-Hbα2-RNAi(4)3x108TU/ml.调整好K562细胞状态,将4个慢病毒颗粒分别对K562细胞进行感染,感染3天后荧光显微镜下观察RFPRFP表达情况,荧光率达80%以上,收集细胞抽提RNA,反转录为cDNA,real-time PCR检测目的基因α-珠蛋白基因Hbα2的mRNA表达水平.从定量PCR结果可以看出， K562细胞中,相对于NC阴性对照组， KD2(LV-Hbα2-RNAi/2)组Hbα2基因敲减效率达到76.5% (P<0.05),认为是α-珠蛋白基因Hbα2的有效靶点.对有效靶点进行大量的慢病毒包装,包装后观察荧光表达,浓缩病毒最后滴度为6x108TU/ml.
4.人β-珠蛋白基因慢病毒LV-β-globin转染K562细胞72h后,细胞发出GFP,且显示有大量荧光表达,流式细胞检测荧光效率94.8%,而空白组K562细胞中无荧光表达.α-globin-RNAi慢病毒转染已经稳定表达人β-珠蛋白基因的K562细胞,感染72h后,红色滤片下观察细胞发出RFP,同时用GFP滤片观察,同样细胞表达GFP,流式细胞检测双色荧光感染效率为91.3%,显示2个慢病毒均在细胞中稳定转染及表达,而空白组K562细胞中只有GFP表达,无RFP表达.用RT-PCR检测β-珠蛋白基因扩增得到227bp的特异性条带,α-珠蛋白表达得到85 bp的特异性条带,real time PCR检测β-珠蛋白基因mRNA 2-△△Ct值4.080±0.078,α-珠蛋白mRNA 2-△△Ct值0.274±0.023,提示2个慢病毒转染后β-珠蛋白基因mRNA水平高表达于对照组4.08倍(P<0.05),α-珠蛋白基因mRNA抑制率达到了72.3%（P<0.05).运用人类α-及β-珠蛋白单克隆抗体进行了western blotting检测,发现在稳定转染后的K562细胞中人β-珠蛋白的合成明显高于空白组和阴性对照组,而α-珠蛋白的合成则明显低于空白组和阴性对照组.western blotting检测发现β-珠蛋白蛋白灰度值值为1.063±0.082,表达较基础值增高3.6倍(P<0.05),而α-珠蛋白蛋白灰度值值为0.327±0.042,表达明显减弱,蛋白水平干扰率达68.3% (P<0.05),差异均有统计学意义.
结论
本研究首次成功将构建好的人β-珠蛋白基因及α-珠蛋白基因siRNA两种慢病毒载体高效、稳定转染进K562细胞.研究中2种慢病毒转染后β-珠蛋白基因mRNA水平高于对照组4.08倍,蛋白水平高表达于对照组3.6倍,α-珠蛋白基因mRNA水平抑制率达到72.3%,蛋白水平抑制率达68.3%,明显高于国内外既往研究.实现以调整了α/β珠蛋白的表达的基因治疗理念,为使β0型地中海贫血症状得到缓解奠定了治疗基础,为β0型基因敲除小鼠模型的基因治疗实施做好细胞基础研究的准备.
β-地中海贫血是一种对人类健康危害严重的遗传性溶血性贫血病,是因β-珠蛋白基因及其调控序列的点突变或缺失致使β-珠蛋白肽链合成减少或完全停止.β-地中海贫血的发病机制中有一类属于翻译缺陷型:突变或减少的编码序列引起的终止密码子,使得β-珠蛋白基因信使RNA合成中断,导致β-珠蛋白肽链无法正常合成,而发生β0地中海贫血,如移码突变CD41-42(-CTTT)突变和CD27/28(+C).这不仅使患者血红蛋白水平降低,而且使原来在数量上与之持平的α-珠蛋白肽链相对过剩,这些相对过剩的游离α-珠蛋白肽链并不能形成稳定的四聚体,它们沉积在红细胞中导致了大量无效红细胞生成和红细胞膜破坏而导致红细胞寿命缩短,而β-珠蛋白根本无法表达而引起了严重的溶血性贫血.近年来,新型病毒载体HIV慢病毒载体已经成功的运用到了β-地中海贫血的基因治疗中,尤其是剪接缺陷型β-地中海贫血,这类地中海贫血可以通过慢病毒介导RNA干扰可以使得例如内含子1(如IVS-I-110,IVS1-6,IVS1-5)或者内含子2的异常剪接(如IVS-Ⅱ-654,IVS-Ⅱ-745)的前体mRNA的剪接位点的异常表达的反义序列恢复,从而恢复正确的拼接序列,最终恢复血红蛋白的合成[1-7].
但是针对翻译缺陷型地中海贫血类型基因治疗的研究较少,这类型地中海贫血因为缺失片段大,现阶段无法通过RNA修复及干扰技术将其恢复正常碱基表达和肽链结构从而改善血红蛋白表达.所以只能通过导入正常人β蛋白基因补充或降低α-珠蛋白基因表达来调整α/β珠蛋白比例,但是α-珠蛋白基因干扰的有效率,β-珠蛋白基因及其调控片段的稳定表达的有效性,及α/β比例控制及协调的长期稳定性一直没有得到有效的印证.同时此类型的β重型地中海贫血基因敲除小鼠子代(th3/th3)常常死于妊娠后期,而使得该小鼠模型的研究一直受阻.
本课题在人红白血病细胞株K562细胞研究的基础上针对了广西最常见β-地中海贫血CD41-42突变型等翻译缺陷型地中海贫血类型,设计将2个慢病毒载体,即全长人β-珠蛋白基因慢病毒载体及α-珠蛋白基因干扰片段慢病毒载体,同时将2个慢病毒载体导入K562细胞以实现升高β-珠蛋白和降低α-珠蛋白表达来调整α/β珠蛋白比例的构想,为不同类型地中海贫血基因治疗提供更有效的证据及策略.同时对翻译突变型CD41-42型基因载体的设计及细胞模型的构建为进一步地中海贫血基因敲除小鼠模型及体内基因治疗的实施做好基础研究的准备.
研究目标
1.PCR扩增全长人β-珠蛋白基因,将目的基因片段和慢病毒载体连接,筛选获得慢病毒表达载体LV-β-globin(GFP),并进行测序验证.包装病毒,测定病毒浓度.
2.验证K562细胞上α-珠蛋白基因的mRNA表达情况,模拟β0地中海贫血的细胞模型.
3.设计及合成4个针对α-珠蛋白基因的RNAi慢病毒载体(RFP).将4个载体稳定转染K562细胞,real time PCR检测α-珠蛋白mRNA表达及干扰效率,筛选最有效的1个干扰片段用于后续实验.
4.将构建好的全长人β-珠蛋白基因慢病毒及α-珠蛋白基因RNAi慢病毒稳定转染K562细胞.检测α-珠蛋白及β-珠蛋白基因mRNA及蛋白表达,观察基因添加及干扰效果,以验证α/β珠蛋白比例调节使得β0型地中海贫血症状得到缓解的研究目的.
方法
1.提取人β-珠蛋白表达正常者的DNA,PCR扩增全长2l00bp人β-珠蛋白基因片段,加上SphI和NotI两个酶切位点进行T载体克隆,获得重组质粒pUC57-β-globin.用限制性内切酶,将目的基因片段和慢病毒载体pLVEFla/GFP+Puro连接,筛选获得慢病毒表达载体LV-β-globin,并进行测序验证.验证后将慢病毒载体转染293T细胞,包装病毒,测定病毒滴度.
2.将人慢性髓原白血病细胞K562细胞培养至对数增长期,选取人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MCF-7、人脑星形胶质母细胞瘤细胞U87作为对照组,进行α-珠蛋白基因(Hbα2) RNA检测,检测Hbα2含量.设计目的基因及内参基因GAPDH引物,real-time PCR检测α-珠蛋白基因mRNA(Hbα2)含量.
3.针对目的基因序列,利用RNA干扰序列设计原则,根据设计经验和设计软件评估,选择4个最佳的动力学参数RNA干扰靶点序列.分别命名为Hbα2-RNAi(1)，Hbα2-RNAi(2)，Hbα2-RNAi(3)，Hbα2-RNAi(4).合成含干扰序列的单链DNA oligo,退火配对产生双链,再通过其两端所含酶切位点AgeI和EcoRI直接连入酶切后的慢病毒载体骨架PGCSIL-017上;将连接产物转入制备好的感受态细胞,PCR鉴定阳性重组子后,送测序验证.
4.将人β-珠蛋白基因慢病毒LV-β-globin加入生长状态良好的K562细胞.感染3天后,观察感染效率及细胞荧光表达情况.在已经稳定转染了LV-β-globin的K562细胞接种到适宜密度后加入高MOI值筛选后的α-globin-RNAi慢病毒,感染3天后,观察感染效率及细胞荧光情况,运用流式细胞仪检测荧光效率.稳定转染后的K562细胞株,提取细胞总RNA,运用real-time PCR检测K562细胞中α-珠蛋白基因(Hbα2)及β-珠蛋白基因(HBB)mRNA表达情况.再运用western blotting检测α-珠蛋白及β-珠蛋白的蛋白表达情况.
结果
1.通过PCR获得长度为2128bp带有SphI和NotI序列的全长人β-珠蛋白基因.pUC57载体和慢病毒表达载体LV连接,慢病毒表达载体LV-β-globin构建成功,序列正确.提示成功构建包装含人正常β-珠蛋白基因的慢病毒载体.
2.结果显示Hbα2在K562中的表达丰度为高,在MCF-7,HEPG2中的表达丰度为中,在U87中的表达丰度为低.验证实验结果提示人慢性髓原白血病细胞K562细胞含有红系特性,高量表达α-珠蛋白基因(Hbα2)适宜作为本实验模型细胞,模拟β0表现的翻译缺陷型地中海贫血血液细胞.
3.显示连接入vshRNA片段的阳性克隆PCR片段大小为342bp,没有连接入vshRNA片段的空载体克隆PCR片段大小为307bp.测序结果经比对确认为正确的克隆.PCR验证结果及测序结果一致,对选择的4个慢病毒载体转染293T进行包装.4个α-globin-RNAi干扰载体的包装滴度分别为LV-Hbα2-RNAi(1)3 x108 TU/ml、LV-Hbα2-RNAi (2) 2x108TU/ml， LV-Hbα2- RNAi(3)2x108 TU/ml、LV-Hbα2-RNAi(4)3x108TU/ml.调整好K562细胞状态,将4个慢病毒颗粒分别对K562细胞进行感染,感染3天后荧光显微镜下观察RFPRFP表达情况,荧光率达80%以上,收集细胞抽提RNA,反转录为cDNA,real-time PCR检测目的基因α-珠蛋白基因Hbα2的mRNA表达水平.从定量PCR结果可以看出， K562细胞中,相对于NC阴性对照组， KD2(LV-Hbα2-RNAi/2)组Hbα2基因敲减效率达到76.5% (P<0.05),认为是α-珠蛋白基因Hbα2的有效靶点.对有效靶点进行大量的慢病毒包装,包装后观察荧光表达,浓缩病毒最后滴度为6x108TU/ml.
4.人β-珠蛋白基因慢病毒LV-β-globin转染K562细胞72h后,细胞发出GFP,且显示有大量荧光表达,流式细胞检测荧光效率94.8%,而空白组K562细胞中无荧光表达.α-globin-RNAi慢病毒转染已经稳定表达人β-珠蛋白基因的K562细胞,感染72h后,红色滤片下观察细胞发出RFP,同时用GFP滤片观察,同样细胞表达GFP,流式细胞检测双色荧光感染效率为91.3%,显示2个慢病毒均在细胞中稳定转染及表达,而空白组K562细胞中只有GFP表达,无RFP表达.用RT-PCR检测β-珠蛋白基因扩增得到227bp的特异性条带,α-珠蛋白表达得到85 bp的特异性条带,real time PCR检测β-珠蛋白基因mRNA 2-△△Ct值4.080±0.078,α-珠蛋白mRNA 2-△△Ct值0.274±0.023,提示2个慢病毒转染后β-珠蛋白基因mRNA水平高表达于对照组4.08倍(P<0.05),α-珠蛋白基因mRNA抑制率达到了72.3%（P<0.05).运用人类α-及β-珠蛋白单克隆抗体进行了western blotting检测,发现在稳定转染后的K562细胞中人β-珠蛋白的合成明显高于空白组和阴性对照组,而α-珠蛋白的合成则明显低于空白组和阴性对照组.western blotting检测发现β-珠蛋白蛋白灰度值值为1.063±0.082,表达较基础值增高3.6倍(P<0.05),而α-珠蛋白蛋白灰度值值为0.327±0.042,表达明显减弱,蛋白水平干扰率达68.3% (P<0.05),差异均有统计学意义.
结论
本研究首次成功将构建好的人β-珠蛋白基因及α-珠蛋白基因siRNA两种慢病毒载体高效、稳定转染进K562细胞.研究中2种慢病毒转染后β-珠蛋白基因mRNA水平高于对照组4.08倍,蛋白水平高表达于对照组3.6倍,α-珠蛋白基因mRNA水平抑制率达到72.3%,蛋白水平抑制率达68.3%,明显高于国内外既往研究.实现以调整了α/β珠蛋白的表达的基因治疗理念,为使β0型地中海贫血症状得到缓解奠定了治疗基础,为β0型基因敲除小鼠模型的基因治疗实施做好细胞基础研究的准备.