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植物上有两种形式的NADP-ME,一种是光合型的NADP-ME,另一种是非光合型的NADP-ME。NADP-ME涉及不同生理反应具有许多生理功能,但有关NADP-ME与抗旱节水关系的研究却鲜见报道。目前尚未见在小麦上开展NADP-ME基因克隆及其抗旱等抗逆性的功能研究。
水分利用效率(WUE)是一个将抗旱性和丰产性统一起来的指标。研究小麦NADP-ME与抗旱性及WUE之间的关系,对小麦抗旱性和WUE及产量的遗传改良有重要意义。本研究对晋麦47幼苗进行了干旱(PEG)、盐(NaCl)、低温和黑暗以及外源植物激素ABA、SA处理,研究了不同处理对小麦NADP-ME活性和WUE的影响及在不同处理下小麦NADP-ME和小麦叶片水分利用效率(LWUE)之间的相关性。首次从小麦中克隆了两个TaNADP-ME基因,并对他们的组织表达模式和不同非生物处理下在叶片中的表达模式进行了研究,构建了原核表达载体,获得了TaNADP-ME1和TaNADP-ME2的融合蛋白以期对这2个小麦基因进行酶学研究明确他们的生理功能。同时构建了正反义植物表达载体,获得了T1代转基因拟南芥植株,为明确这2个基因的抗旱节水功能奠定了基础。主要结论如下:
1.不同非生物处理对小麦LWUE和单株WUE均有一定程度的影响。PEG处理提高了小麦LWUE,且呈先上升后下降的趋势。ABA、SA、低温和黑暗处理下小麦LWUE的变化曲线相似,呈现先上升后降低的重复变化趋势。ABA、低温和PEG处理提高了小麦单株WUE,SA和黑暗处理降低了小麦单株WUE,然而NaCl处理对小麦单株WUE没有影响。
2.酶活性测定结果表明不同非生物处理下,小麦NADP-ME活性均高于对照,其中对NaCl胁迫反应最快,处理6 h后酶活性即达到最高,而酶活性受SA影响最大,诱导后的酶活性增高幅度最大。这表明小麦NADP-ME在蛋白水平上对干旱、盐、SA、ABA、低温和黑暗处理均作出了响应。
3.相关和回归分析表明PEG处理下小麦LWUE与小麦NADP-ME活性存在极显著的正相关,并且为幂函数关系。这表明小麦NADP-ME可能参与干旱胁迫下小麦LWUE的调控。这是首次将NADP-ME与LWUE联系起来。其他处理下没有显著的相关性。
4.利用电子克隆和RACE方法从小麦中首次克隆了TaNADP-ME1(NCBI:EU170134)和TaNADP-ME2(NCBI:EU082065)两个基因。这2个基因在氨基酸和核苷酸的相似度分别为73.26%和64.08%。信号肽预测表明TaNADP-ME1基因位于质体中,TaNADP-ME2位于胞质中。
5.多序列比对表明,这2个基因包含5个保守的位点,但有改变。TaNADP-ME1基因SiteⅡ的Ⅰ228改变成T,TaNADP-ME2 SiteⅠ的T121改变为Ⅴ。进化分析表明,TaNADP-ME1和TaNADP-ME2属于单子叶类,并分别与OschlME6和OscytME2的亲源关系最近。
6.半定量PCR分析表明,这2个基因在小麦的根茎叶中组成性表达,且是叶片富含形式的基因。他们对ABA、SA、盐、低温、PEG和黑暗处理在叶片上作出了不同的响应。其中在黑暗处理下检测不到TaNADP-ME2转录本,我们初步认为TaNADP-ME2属于光合型基因。这是在C3植物上发现的第一个具有光合作用的胞质型NADP-ME基因,为在C3植物中建立高效的C4光合途径进而获得丰产奠定了基础。
7.构建了原核表达载体,SDS-PAGE结果表明这2个基因在大肠杆菌中得到了高效表达。用Ni-his tag柱对融合蛋白进行了纯化,活性分析表明纯化的融合蛋白具有生物活性,为生化功能鉴定奠定了基础。
8.构建了正反义植物表达载体pCAME1、pCAAE1、pSUE2和pSUAE2,并获得了pCAME1、pCAAE1和pSUE2 T1代抗性苗,为小麦抗旱节水功能鉴定奠定了基础。