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研究背景：
衰老是发生在分子、细胞以及整体水平上多因素协同引起的生命弱化过程。可靠、易测的衰老生物学指标的确立对衰老机理的研究、衰老相关疾病的诊断、亚健康状态的评估、延缓衰老药物的筛选等至关重要。前期众多研究提示：DNA损伤修复能力可能具有作为细胞衰老标志物的潜在条件[1]。然而，在常规培养条件下以彗星试验观察各代龄细胞DNA损伤水平时却发现：年轻与衰老细胞均无明显慧尾[2]，那么，氧化应激状态下DNA损伤水平与修复能力随增龄变化如何，其机制如何？均有待进一步深入研究。
目的：
本研究拟以人胚肺二倍体成纤维细胞(2BS)为模型，用过氧化氢(H2O2)诱导细胞内氧化应激状态，通过彗星试验(comet assay)分析细胞DNA损伤修复能力与增龄、氧化应激水平的关系；利用RT-PCR、Western blot方法筛选与衰老密切相关的修复基因以期了解衰老细胞DNA损伤修复能力降低的机理，为进一步了解衰老机制和探索新的衰老生物学标志物提供实验基础。
方法：
1.荧光显微镜下观察不同代龄2BS细胞形态变化，并摄取图片。
2.彗星试验检测2BS细胞DNA损伤与修复能力的增龄性变化：1)以体外培养不同代龄2BS细胞为对象，分别设置空白对照组、低剂量(50μmol/L) H2O2损伤组、中剂量(100μmol/L)H2O2损伤组、高剂量(200μmol/L) H2O2损伤组，每组细胞损伤5min后，彗星试验分析在相同氧化应激状态下2BS细胞DNA损伤水平与修复能力的增龄性变化以及同一代龄细胞DNA损伤水平及修复能力与氧化应激水平(H2O2剂量)的关系。2)不同代龄2BS细胞分别经200μmol/L H2O2损伤5min后再经1h修复，彗星试验检测DNA损伤修复能力与细胞代龄的关系。3)激光共聚焦显微镜观察上述实验结果，并经200倍放大摄取图像，每一样本随即选取100个细胞，彗星图像分析软件CASP定量分析上述关系，其中把尾部DNA百分比(Tail DNA％，TDNA％)与Olive尾距(Olive Tail Moment，OTM)作为衡量DNA损伤修复能力的指标，其值越大代表损伤程度越大，修复能力越差[2]。
3.RT-PCR初步筛选与DNA损伤修复密切相关的修复酶：结合相关文献资料，在DNA损伤修复路径上初步选出6种关键酶，RT-PCR方法分别检测这6种酶的基因表达水平在不同代龄2BS细胞中的变化。
4.Western blot分析：通过RT-PCR方法初步确定了DNA聚合酶δ1(DNA polymeraseδ1，polδ1)，利用Western blot方法检测DNA polymeraseδ1在不同代龄2BS细胞内的蛋白表达水平。
结果：
1.彗星试验结果：1)常规培养条件下，各代龄组均未出现明显慧尾。2)2BS细胞经H2O2损伤后，随细胞代龄增加，DNA损伤与修复能力逐渐降低，低浓度(50μmol/L)H2O2处理组OTM值与细胞代龄之间线性关系显著(回归方程为Y=36.143+1.281X，R2=0.949，P=0.026)，而中(100μmol/L)、高(200μmol/L)H2O2处理组其线性关系均不显著(P>0.05)；年轻代龄细胞组OTM值与损伤剂量呈良好的线性关系(回归方程为Y=—7.49+0.144X，R2=0.994，P=0.047)，中年、老年细胞组线性关系均不显著(P>0.05)。3)不同代龄细胞经200μmol/L H2O2损伤后再经1h修复，年轻、中年细胞均未出现明显慧尾，而衰老细胞(>55代)则仍有显著慧尾，表明DNA损伤修复水平与细胞代龄有关，而衰老细胞损伤修复能力显著低于年轻细胞(P<0.05)。
2.RT-PCR结果：DNA polymeraseδ1在众多DNA修复酶基因中被筛选出来，因其表达水平随细胞代龄的增加而显著降低，且其之间线性关系显著(回归方程为Y=26.195-0.16X，R2=0.961，P=0.035)。
3.Western blot结果：与年轻细胞组相比，DNA polymeraseδ1蛋白表达水平在中年，衰老细胞中显著下调，且在衰老细胞中几乎不表达。
结论：
1.氧化应激状态下，DNA损伤水平随增龄而增加，DNA修复能力随增龄而下降；在低剂量氧化应激状态下，DNA损伤修复能力与细胞代龄呈良好的线性关系；年轻代龄细胞DNA损伤修复能力与处理剂量线性关系显著。
2.DNA polymeraseδ1的mRNA的表达水平与细胞代龄呈线性相关关系，且其蛋白表达水平与基因表达水平一致，提示DNA polymeraseδ1可能是又一个与衰老细胞DNA损伤修复能力降低有关的酶。