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苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是目前世界上应用范围最广的杀虫微生物,其杀虫活性主要来源于杀虫基因编码的晶体蛋白。但是,Cry蛋白杀虫谱窄、毒力有限,以及害虫对Bt毒素的抗性风险上升等诸多弱点和因素将严重制约Bt在未来农业生产中进一步发挥巨大作用。但是,继续从自然界中分离克隆得到对害虫具有高毒力的新型Bt cry基因难度不断增加。因此,通过分子设计、蛋白质工程等新的技术对现有的Cry毒素进行改造、使之发挥更大的作用是不少研发单位的新的研究目标。本论文围绕建立一种可控突变率的随机突变文库的方法、苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白Cry1Ie的定向进化等方面进行了一系列的研究,主要结果如下:将cry1Ac基因启动子与cry1Ie基因通过重叠引物PCR的方法连接在一起,构建cry1Ie基因在E. coli JM109中的表达载体。本方法是在建立随机突变文库的过程中,依据Taq DNA聚合酶在合成碱基时的固有误差和突变特性,结合Cry毒素定向进化过程中需要的碱基突变数目,计算得到产生预期碱基突变所需PCR循环数。同时,本研究采用了荧光定量PCR监测PCR过程中DNA扩增来控制Taq DNA聚合酶的聚合反应的次数。在本实验中,以对小菜蛾(Plutella xylostella)、亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)有杀虫活性的cry1Ie为材料,建立3个不同碱基替换率的随机突变文库,文库I、II、III中的每个DNA分子的预期碱基替换个数分别为1个、2个和3个。从3个文库中分别随机挑取100个克隆进行序列测定分析,结果表明,突变的碱基位点在cry1Ie中随机均匀分布;文库I、II、III突变的单克隆数分别为59个、93个和98个;无义突变的克隆数分别为36个、43个、50个,错义突变的克隆数分别为13个、41个、38个;平均碱基替换个数为0.86个、2.1个、2.79个。综合以上结果发现,本研究设计的方法可以很好控制突变文库的碱基突变率,预期突变2个碱基的文库最适合用作Cry毒素的定向进化。建立随机突变文库之后,进一步用小菜蛾进行生物活性的测定。测试了92个错义突变的突变株,结果表明与未突变的Cry1Ie(LC50为1.96252μg/ml)相比活性升高的有11株,其LC50分别是0.20470、0.81601、0.15063、0.44387、0.61911、0.49740、0.29259、0.51284、0.58315、0.29723、0.67218μg/ml,氨基酸的变化分别是Y162H&E181K,N214S、V236A、K237R、Y239H&A307V、N258Y、I285T&R506G、P320H&Y599N、Y422H、I507V、A522V,这些突变位点分布在Cry1Ie的三个结构域中,其中活性提高最明显是的位于结构域II中的双突变体Y239H&A307V,提高了13倍。研究结果显示,本研究所设计的定向进化方法适合Cry毒素的定向进化,并开发一种简单的可控突变率的随机突变文库建立方法;同时本项研究采用了我国主知识产权的cry1Ie基因为实验材料,并筛选到了11株对小菜蛾活性提高的突变体,这也为我国转Bt基因植物提供了新的材料。