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第一部分:miRNA-Let-7i及TLR4在颞叶癫痫患者及癫痫模型大鼠脑组织中的表达研究目的:检测miRNA-Let-7i及其下游靶点TLR4在颞叶癫痫患者术后脑组织标本以及癫痫模型大鼠脑组织标本中的表达。方法:1、从难治性颞叶癫痫患者术后脑组织库中随机抽取6例颞叶脑组织标本作为癫痫组,抽5例临床资料匹配的颅脑外伤患者术后颞叶脑组织标本作为对照组。2、选择成年雄性SD大鼠,随机分为匹罗卡品急性癫痫组和戊四氮慢性点燃癫痫组,每组中选择成功点燃的大鼠作为癫痫组,未点燃的大鼠作为对照组。3、使用实时荧光定量PCR技术检测miRNA-Let-7i在颞叶癫痫患者及两种癫痫模型大鼠脑组织标本中的表达变化。4、使用Western-blot检测TLR4在颞叶癫痫患者及两种癫痫模型大鼠脑组织标本中的表达变化。结果:1、miRNA-Let-7i在颞叶癫痫患者脑组织中的表达水平较对照组明显降低(P<0.05);2、mirna-let-7i在戊四氮慢性点燃癫痫模型及匹罗卡品急性癫痫模型中,点燃组海马和皮质中的表达水平较未点燃的大鼠降低降低(p<0.05);3、tlr4在颞叶癫痫患者脑组织中的表达水平较对照组明显升高(p<0.05);4、tlr4在戊四氮慢性点燃及匹罗卡品急性癫痫模型海马中,点燃组表达水平较未点燃的大鼠升高(p<0.05)。结论:mirna-let-7i在颞叶癫痫患者和两种癫痫模型大鼠脑组织中的表达水平均降低,其下游靶点tlr4在颞叶癫痫患者和两种癫痫模型大鼠脑组织中的表达水平升高,提示mirna-let-7i与其靶点tlr4在癫痫的发生发展过程可能一定的作用。第二部分干预mirna-let-7i对tlr4的表达及癫痫模型动物行为学的影响目的:检测mirna-let-7i特异性激动剂和抑制剂的干预效率及特异性;观察agomir及antagomir干预后对癫痫模型大鼠行为学的影响。使用tak-242特异阻滞tlr4,检测mirna-let-7i-tlr4通路在癫痫动物中的作用;检测tak-242对tlr4的抑制效率。方法:1、选用成年雄性sd大鼠,随机分为3组,分别为对照组(control组),agomir组(0.2nmol/侧),antagomir组(0.4nmol/侧)。agomir和antagomirs均为双侧海马区立体定位微量注射。使用实时荧光定量pcr和激光共聚焦技术检测agomir及antagomir的干预效率;使用实时荧光定量pcr检查mirna-let-7b在agomir及antagomir干预后的表达;使用western-blot检测agomir及antagomir干预后脑组织中tlr4的表达情况。2、选用成年雄性sd大鼠,随机分为正常对照组,假手术组(灭菌ddh2o4μl/侧海马),agomir组(0.2nmol/侧海马),antagomir组(0.4nmol/侧海马)及antagomir(0.4nmol/侧海马)+tak-242(0.5mg/kg)组。灭菌ddh2o、agomir和antagomirs均为双侧海马区立体定位微量注射;tak-242采用尾静脉注射。3、腹腔注射匹罗卡品(320mg/kg)建立匹罗卡品急性癫痫模型,观察各组大鼠观察注射匹罗卡品后1小时内不同时间点(10min、20min、30min、40min、50min、60min)中发作的严重评分;每日腹腔注射阈下剂量戊四氮(35mg/kg)建立戊四氮慢性点燃癫痫模型,观察各组大鼠完全点燃所需的时间和每日注射后半小时内痫性发作的最高级别。4、使用western-blot检测tlr4下游炎性因子il-6及tnf-α在假手术组,antagomir组及antagomir+tak-242组表达。结果:1、agomir干预后,mirna-let-7i的表达水平与对照组相比,在干预后第3天,1周,2周及4周组的表达均升高(p<0.05);tlr4在干预后第3天,1周,2周及4周组的表达水平与对照组相比均降低(p<0.05)。antagomir干预后,mirna-let-7i在第3天,1周,2周及4周与对照组相比表达水平均降低(p<0.05);tlr4在干预后3天,1周,2周及4周组的表达水平与对照组相比均升高(p<0.05)。选择agomir及antagomir干预后效果最佳的第3天组以及对照组,q-pcr检测mirna-let-7b表达水平各组之间无明显差异(p>0.05);agomir和antagomir海马注射后1周取脑组织切片,使用激光共聚焦检测显示海马各区可见带有绿色荧光的干预剂扩散转染。2、在匹罗卡品急性癫痫模型中,agomir组的点燃潜伏期较对照组和假手术组延长;注射匹罗卡品后,在时间点(30min、40min、60min)的痫性发作评级较对照组和假手术组降低(p<0.05)。与对照组和假手术组相比,点燃潜伏期在antagomir组明显缩短;在时间点(10min、20min、30min)痫性发作评级较对照组和假手术组升高(p<0.05)。antagomir+tak-242组的潜伏期及各时间点发作评级较对照组和假手术组无明显差异(p<0.05)。3、在戊四氮慢性点燃癫痫大鼠模型中,agomir组完全点燃所需要的时间较对照组和假手术组明显延长(p<0.05);痫性发作级别在第7-15天较对照组和假手术组降低(p<0.05)。antagomir组完全点燃所需要的时间较对照组和假手术组明显缩短(p<0.05);痫性发作级别在第3-10天时较对照组和假手术显著组增加(p<0.05)。4.tlr4下游炎性因子il-6及tnf-α在antagomir组表达较假手术组明显升高,在antagomir+tak-242组表达较antagomir组及假手术组降低,变化均有统计学差异(p<0.05)。结论:1、mirna-let-7iagomir/antagomir干预可特异性改变大鼠海马mirna-let-7i及tlr4的表达水平;mirna-let-7i在大鼠海马组织中可负向调节tlr4表达。2、agomir干预后可以改善癫痫模型大鼠发作的潜伏期和严重程度;antagomir干预后可以加重癫痫模型大鼠发作的潜伏期和严重程度。3、tak-242特异阻滞tlr4后可抑制antagomir对癫痫模型大鼠行为学的影响以及对il-6及tnf-α表达的上调作用。第三部分mirna-let-7i对癫痫持续状态后大鼠海马神经元凋亡的影响目的:对匹罗卡品所致癫痫持续状态后大鼠使用antagomir和agomir特异性抑制和上调mirna-let-7i,观察干预对海马神经元凋亡的影响,评价mirna-let-7i对癫痫持续状态后大鼠海马神经元凋亡的保护作用。方法:1、选用成年雄性sd大鼠,随机分为对照组(control组),agomir组,antagomir组antagomir+tak-242组(tak-242组)。各组腹腔注射匹罗卡品(320mg/kg)建立匹罗卡品急性癫痫模型。癫痫持续状态(statusepilepticusse)后24小时行双侧海马区立体定位微量注射,agomir组(agomir0.2nmol/侧海马),antagomir组(antagomir0.4nmol/侧海马)及antagomir+tak-242组(antagomir0.4nmol/侧海马,tak-2420.5mg/kg尾静脉注射),control组(注射灭菌dd H2O。0.4 nmol/侧海马)。2、根据前面实验结果在干预效果最强的第3天取各组大鼠脑组织,采用Nissl及Tunel染色观察各组大鼠海马各区细胞凋亡及存活情况,结果:1、大鼠海马CA1、CA3及DG区细胞Tunel染色显示agomir组凋亡率较对照组明显降低;Nissl染色显示agomir组存活率较对照明显升高(P<0.05)。2、大鼠海马CA3及DG区细胞Tunel染色显示antagomir组凋亡率较对照组明显升高,Nissl染色显示antagomir组存活率较对照组明显降低(P<0.05)。CA1区Tunel染色及Nissl染色antagomir组与对照组无明显差异(P>0.05)。3、TAK-242组大鼠海马CA1、CA3及DG区细胞Tunel染色显示其凋亡率较antagomir组和对照组明显降低(P<0.05);Nissl染色显示其存活率较antagomir组及对照组明显升高(P<0.05)。结论:1、上调miRNA-Let-7i可显著减轻大鼠SE后海马神经元的凋亡。2、抑制miRNA-Let-7i可显著加重大鼠SE后海马神经元的凋亡,TAK-242特异阻滞TLR4后可抑制antagomir下调miRNA-Let-7i所致神经元凋亡加重的作用。