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目的:大脑对缺氧最为敏感,缺氧可导致脑水肿和神经细胞受损,严重影响大脑功能。对于不同程度的乏氧性缺氧（hypoxic hypoxia）,大脑将表现出不同程度的神经功能紊乱,如急性重度缺氧将引起头痛、烦躁、惊厥、昏迷甚至死亡;慢性中度缺氧将引起疲劳、嗜睡、注意力不集中、记忆力下降等症状;而轻度及早期乏氧性缺氧发生时由于脑血管及星形胶质细胞系统的代偿性低氧保护反应,可为神经元提供充分的氧供和能量底物,以维持大脑的正常生理功能,因此,研究轻度缺氧条件下中枢神经系统（central nervous system,CNS）代偿性低氧保护机制,对于乏氧性缺氧脑损伤疾病的预防和治疗具有重要意义。CNS结构与功能错综复杂,神经血管单元（neurovascular units,NVU）是其最小结构与功能单位,该模型主要由脑微血管、星形胶质细胞和神经元共同构造组成。星形胶质细胞处于NVU物质转运与信息传递的中心,充当神经元与微血管之间的纽带与桥梁作用。当星形胶质细胞感受到氧供减少后,能够启动代偿性低氧保护反应,包括减少葡萄糖有氧氧化、增加无氧糖酵解,降低自身氧耗、促进葡萄糖与乳酸转运、释放血管新生因子等,是维持神经元正常生理功能的重要代偿机制。根据NVU结构的特点,脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cell,BMEC）紧临血液,可最先感知血氧分压降低,其后才是星形胶质细胞和神经元。因此如能在星形胶质细胞感受到氧供减少前启动代偿性低氧保护反应,对于维持神经元细胞的正常生理功能无疑具有更为重要的生理意义。在缺氧发生时,BMEC最先感受到血氧分压降低,并引起一系列的血管系统代偿性低氧保护反应,而最重要也是最快速的代偿方式是通过舒张血管的作用增加局部组织供氧量,此过程是内皮细胞释放一氧化氮（nitric oxide,NO）,并扩散至血管平滑肌细胞,通过活化可溶性鸟苷酸环化酶（s GC）的方式启动舒张血管作用,而内皮细胞释放的NO能否继续扩散至其他邻近细胞,并发挥相应的生理功能与效应,有待进一步探索。NO是重要的细胞信使分子,参与机体多种生理或病理过程,在机体心血管系统、神经系统和免疫系统中发挥重要的生物学作用。研究表明NO除了具有舒张血管的作用外,还参与低氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）的稳定性调控,通过干预脯氨酰羟化酶（PHD）绑定Fe2+而阻断PHD酶的活性,从而阻断HIF-1α的降解,还可通过PI3K/Akt/m TOR信号通路诱导HIF-1α表达上调。鉴于NO分子可调控HIF-1α稳定性与表达水平,并且是重要的内源性细胞信使分子,无疑是理想的低氧信号传导分子,因此我们将NO分子作为重要的非氧气的调节因素与信息分子进行低氧信号传导的研究对象。既然轻度缺氧时,BMEC释放的NO能够作为低氧信号扩散至血管平滑肌细胞产生舒张血管的作用,那么BMEC释放的NO能否继续扩散至邻近的星形胶质细胞,并在其未感知缺氧时通过HIF-1α启动代偿性低氧保护反应?有待研究证实。基于上述分析,本研究拟分离培养大鼠原代脑星形胶质细胞和原代BMEC,探索脑星形胶质细胞未感受缺氧的氧气阈值浓度,并在此缺氧条件下研究外源性给药产生和共培养BMEC源性释放的NO预处理能否阻断脑星形胶质细胞HIF-1α蛋白的降解,以及对葡萄糖代谢与无氧糖酵解、葡萄糖和乳酸转运、血管新生等相关基因的转录和表达调控;同时对照清除NO或抑制NO生成,并结合运用RNAi技术干扰HIF-1α基因转录,探索NO-低氧信号如何介导脑星形胶质细胞的低氧保护反应,以期初步阐明BMEC源性NO介导的低氧信号传导启动脑星形胶质细胞低氧保护反应的作用机制,为进一步研究乏氧性缺氧脑损伤疾病的致病机制与干预保护措施奠定基础。方法:第一部分大鼠脑星形胶质细胞、脑微血管内皮细胞的原代分离培养与鉴定1.分离培养原代脑星形胶质细胞及细胞鉴定:采用一步酶消化及振荡纯化的方法分离培养大鼠大脑星形胶质细胞;免疫荧光染色法检测GFAP的表达用于脑星形胶质细胞的鉴定;2.分离培养原代脑微血管内皮细胞及细胞鉴定:采用两步酶消化、梯度密度离心及嘌呤霉素纯化的方法分离培养大鼠大脑微血管内皮细胞;免疫荧光染色法检测v WF相关抗原的表达用于脑微血管内皮细胞的鉴定。第二部分外源性NO启动轻度缺氧星形胶质细胞低氧保护反应的实验研究1.不同氧气浓度条件对原代脑星形胶质细胞HIF-1α蛋白水平的影响:Western blot检测21%、9%、7%、5%、3%和1%氧气浓度条件下星形胶质细胞HIF-1α蛋白水平,以获得星形胶质细胞未感受缺氧的氧气阈值浓度;2.5%O2轻度缺氧条件下,DETA（NO供体）对原代脑星形胶质细胞HIF-1α蛋白水平的影响:Western blot检测DETA不同剂量处理和不同处理时间后脑星形胶质细胞HIF-1α蛋白水平;3.5%O2轻度缺氧条件下,DETA对原代脑星形胶质细胞葡萄糖代谢相关酶基因、葡萄糖和乳酸转运体蛋白基因、血管内皮生长因子（VEGF）基因转录水平,VEGF蛋白表达水平和乳酸（LAC）释放水平的影响:RT-q PCR检测DETA处理后脑星形胶质细胞PDK1、LDHA、LDHB、HK1、HK2、GLUT1、GLUT3、MCT1、MCT2、MCT4、VEGF基因转录水平;Western blot检测DETA处理后脑星形胶质细胞VEGF蛋白水平,酶促动力学比色法检测培养液LAC释放水平;4.干扰原代脑星形胶质细胞HIF-1α基因转录后,DETA对5%O2轻度缺氧条件下脑星形胶质细胞葡萄糖代谢相关酶基因、葡萄糖和乳酸转运体蛋白基因、VEGF基因转录水平,VEGF蛋白表达水平和LAC释放水平的影响:采用HIF-1α特异性si RNA干扰原代脑星形胶质细胞HIF-1α基因转录,RT-q PCR和Western blot鉴定细胞转染效率;RT-q PCR检测DETA处理后脑星形胶质细胞PDK1、LDHA、HK1、HK2、GLUT1、MCT4、VEGF基因转录水平;Western blot检测DETA处理后星形胶质细胞VEGF蛋白水平,酶促动力学比色法检测培养液LAC释放水平。第三部分脑微血管内皮细胞源性NO启动轻度缺氧星形胶质细胞低氧保护反应的实验研究1.5%O2轻度缺氧条件下,原代脑微血管内皮细胞和原代脑星形胶质细胞NO的释放水平:荧光分析法分别检测脑微血管内皮细胞和脑星形胶质细胞培养液中Nitrite/Nitrate水平;2.5%O2轻度缺氧条件下,脑微血管内皮细胞源性NO对原代脑星形胶质细胞HIF-1α蛋白水平的影响:采用Transwell培养板进行原代脑微血管内皮细胞与原代脑星形胶质细胞共培养,Western blot检测共培养后脑星形胶质细胞HIF-1α蛋白水平;3.5%O2轻度缺氧条件下,脑微血管内皮细胞源性NO对原代脑星形胶质细胞葡萄糖代谢相关酶基因、葡萄糖和乳酸转运体蛋白基因、VEGF基因转录水平,VEGF蛋白表达水平和LAC释放水平的影响:采用Transwell培养板进行原代脑微血管内皮细胞与原代脑星形胶质细胞共培养;RT-q PCR检测脑星形胶质细胞PDK1、LDHA、HK1、HK2、GLUT1、MCT4、VEGF基因转录水平;Western blot检测原代脑星形胶质细胞VEGF蛋白水平;酶促动力学比色法检测培养液LAC释放水平。结果:第一部分:1.获得原代培养的大鼠大脑星形胶质细胞,纯度为98.4%;2.获得原代培养的大鼠脑微血管内皮细胞,纯度为95.2%。第二部分:1.与常氧条件（21%O2）相比,13%氧气浓度条件下,原代脑星形胶质细胞HIF-1α蛋白水平显著升高,而59%氧气浓度条件下,HIF-1α蛋白水平无显著性变化,提示5%O2氧气浓度条件是原代脑星形胶质细胞未感受缺氧的临界浓度,我们将此低氧条件定义本实验研究的轻度缺氧条件;2.5%O2轻度缺氧条件下,1.0 m M DETA（NO供体）预处理12 h能够诱导原代脑星形胶质细胞HIF-1α蛋白水平上调,但能被NO清除剂抑制;3.5%O2轻度缺氧条件下,DETA预处理后原代脑星形胶质细胞PDK1、LDHA、HK1、HK2、GLUT1、GLUT3、MCT4、VEGF基因转录水平显著升高,VEGF蛋白水平和LAC释放水平显著升高;4.5%O2轻度缺氧条件下,干扰原代脑星形胶质细胞HIF-1α基因转录能够抑制DETA上调PDK1、LDHA、HK1、HK2、GLUT1、GLUT3、MCT4、VEGF基因转录,抑制VEGF蛋白表达和LAC释放。第三部分:1.5%O2轻度缺氧条件下,原代脑星形胶质细胞产生和释放的NO较少（86±41 n M Nitrite/Nitrate）,而原代脑微血管内皮细胞能够释放一定量的NO（832±83 n M Nitrite/Nitrate,与0.8 m M DETA释放的Nitrite/Nitrate峰值浓度相当）,但能被NOS抑制剂抑制;2.5%O2轻度缺氧条件下,原代脑微血管内皮细胞与原代脑星形胶质细胞共培养后能够诱导脑星形胶质细胞HIF-1α蛋白水平的上调,但能被NOS抑制剂抑制;3.5%O2轻度缺氧条件下,原代脑微血管内皮细胞与原代脑星形胶质细胞共培养后能够上调脑星形胶质细胞PDK1、LDHA、HK1、HK2、GLUT1、MCT4、VEGF基因转录,上调VEGF蛋白表达和LAC释放,但能被NOS抑制剂抑制。结论:在5%O2轻度缺氧条件下,体外培养的原代大鼠脑星形胶质细胞未感受到低氧,而此低氧条件下给予NO供体药物和共培养脑微血管内皮细胞均能够使脑星形胶质细胞感受到低氧,并上调HIF-1α下游的与无氧糖酵解、葡萄糖和乳酸转运、血管新生等低氧代偿作用相关的酶或因子的基因转录或表达;对照清除NO或抑制NO生成,以及干扰HIF-1α基因转录的结果表明,NO通过阻断HIF-1α的降解,上调其下游的基因转录或表达。综上所述,轻度缺氧时原代大鼠脑微血管内皮细胞释放的NO可作为低氧信号,扩散传导至脑星形胶质细胞,并通过HIF-1α启动脑星形胶质细胞的低氧代偿性保护反应。本研究丰富了NO作为内源性细胞信号分子的效应机制,阐释了一种轻度缺氧时神经血管单元细胞间低氧信号的传导途径,为进一步研究乏氧性缺氧脑损伤疾病的致病机制与干预保护措施奠定了基础。