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烷基吡嗪是一类含有烷基基团的含氮杂环化合物,作为重要的风味贡献化合物广泛存在于发酵食品中。其中,2,5-二甲基吡嗪（2,5-Dimethylpyrazine,2,5-DMP）因具有浓厚的烘烤气味而对发酵食品的风味贡献更加独特。此外,2,5-DMP还可以作为重要的医药和香料中间体,其生产方法主要为化学合成。因2,5-DMP的微生物合成途径未被阐明,使得2,5-DMP在微生物合成领域缺乏研究。在前期工作中,本课题组在酱香型白酒的高温大曲中筛选到一株Bacillus subtilis XZ1124,L-苏氨酸的添加有利于该菌株合成2,5-DMP,暗示2,5-DMP可以通过微生物发酵生成。基于此结果,本研究以B.subtilis 168为研究对象,对2,5-DMP微生物合成途径进行了解析。在此基础上,推测2,5-DMP的微生物合成途径可能参与其他含单甲基半环的烷基吡嗪的微生物合成,并以三甲基吡嗪（2,3,5-Trimethylpyrazine,TMP）为例进行了验证。基于2,5-DMP微生物合成途径的解析,本研究构建了一株可以利用L-苏氨酸为底物高产2,5-DMP的基因工程菌株,首次实现了2,5-DMP高效的生物转化。本研究丰富了对烷基吡嗪微生物合成途径的认知,有助于改进发酵食品中重要风味物质2,5-DMP以及含单甲基半环的烷基吡嗪的合成及工艺控制。此外,将为实现2,5-DMP的生物转化或生物催化提供理论依据,进而有助于促进利用生物法生产2,5-DMP的研究与发展。主要研究内容包括:（1）2,5-DMP微生物合成途径的解析。通过底物添加培养、同位素示踪以及全细胞催化,确定了L-苏氨酸可以作为2,5-DMP微生物合成的唯一底物来源,氨基丙酮为2,5-DMP合成过程中的中间代谢物,其转化为2,5-DMP是一种pH依赖性的非酶促反应。通过来源于B.subtilis 168的苏氨酸脱氢酶（L-Threonine-3-dehydrogenase,TDH）纯酶催化L-苏氨酸以及B.subtilis 168菌株中TDH编码基因tdh的敲除和回补实验,确定了TDH是以L-苏氨酸为底物的2,5-DMP微生物合成途径中的关键酶,其催化L-苏氨酸生成氨基丙酮。通过B.subtilis 168菌株中2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶（2-Amino-3-ketobutyrate CoA ligase,KBL）编码基因kbl的敲除与回补实验,发现与TDH编码基因tdh共转录的kbl基因在2,5-DMP微生物合成途径中起着重要作用,kbl编码酶KBL可显著降低微生物利用L-苏氨酸为底物合成2,5-DMP的能力。（2）TMP微生物合成途径的初步解析。通过同位素示踪和全细胞催化实验,确定了微生物可以同时利用L-苏氨酸和D-葡萄糖或单独利用L-苏氨酸生成TMP。另外,通过B.subtilis 168菌株中TDH编码基因tdh的敲除和回补实验,发现以L-苏氨酸为底物的2,5-DMP微生物合成途径中的关键酶TDH在以L-苏氨酸为底物的TMP微生物合成途径中同样起着关键作用,2,5-DMP微生物合成途径参与TMP的微生物合成,暗示2,5-DMP微生物合成途径可能参与其他含单甲基半环的烷基吡嗪的微生物合成。（3）以L-苏氨酸为底物的2,5-DMP高产菌株的构建。通过在B.subtilis 168中外源表达七种不同微生物种属来源的TDH,发现来源于Escherichia coli K-12的TDH在B.subtilis 168中过表达更有利于B.subtilis 168利用L-苏氨酸为底物合成2,5-DMP。在此基础上进一步外源表达NADH氧化酶（NADH oxidase,NOX）以促进辅因子NAD+再生,发现在TDH过表达的基础上,NOX的参与促进了2,5-DMP产量的提高。本研究成功构建得到一株可以利用L-苏氨酸为底物高产2,5-DMP的基因工程菌株B.subtilis168/pMA0911-tdh（E.c）-nox,该菌株可以在含有5.8 g?L-1的L-苏氨酸的LB液体培养基中发酵24 h,便可积累2,5-DMP产量高达616.0 mg?L-1,与对照菌株B.subtilis 168/pMA0911相比,产量提高了22.5倍。