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腾冲嗜热厌氧菌是一个较为理想的嗜热菌研究模型。本实验室采用定量蛋白质组分析的方法在腾冲嗜热菌中发现了一系列温度依赖性的蛋白质组。我们在其基因组一段56Kb区域中鉴定到9个连续分布的温度依赖性基因簇。这些基因簇具有较为典型的操纵子结构特点，其中基因表达受温度调控的模式基本一致，而且大部分基因的功能尚不确定。我们假设，该56Kb区域中可能存在一些共同的DNA结合蛋白质，在温度变化条件下它们能够发挥一致的调节基因表达的作用。 我们首先根据操纵子数据库和预测软件，从理论上判断56Kb区域中可能含有的操纵子及其可能的边界;然后利用RT-PCR方法鉴定该区域的基因是否由一些启动子调控进行共转录。我们成功地检测到了若干相邻基因间隔区域的扩增产物，确定了其中的6个操纵子。同时，我们以腾冲嗜热菌gal操纵子的启动子区为DNA结合蛋白质的测试目标，通过化学合成法获取带有biotin的210bp长的相应DNA片段，并将该片段与avidin包被的磁珠以及腾冲嗜热菌蛋白质提取液共孵育，然后采用电泳分离和质谱鉴定的方法分析所富集的蛋白质。我们从DNA浓度、蛋白质浓度、缓冲液盐浓度、洗涤液盐浓度等方面系统地考察了DNA-蛋白质复合物的亲和富集方法;最终在本实验室建立了稳定高效的DNApull down技术平台。 我们从已确定的56K区域6个操纵子中选取3个操纵子的启动子区DNA片段(分别命名为2036、2070和2086)，运用已建立的DNA pull down技术，开展了相关操纵子的DNA结合蛋白质组分析。我们在55℃和75℃温度下培养腾冲厌氧嗜热菌，并提取蛋白质;我们把蛋白质提取液与DNA和磁珠孵育，用高盐缓冲液将这些操纵子DNA结合的蛋白质从avidin磁珠上洗脱。继而，我们采用了两种方法检测与相应的DNA片段结合的蛋白质，一方面用SDS-PAGE分离洗脱蛋白质并以银染方法观察所分离的蛋白质，然后用质谱鉴定染色胶带所含的蛋白质;另一方面，直接采用胰蛋白酶随机水解的方法消化洗脱蛋白质，再利用高精度质谱鉴定其中的蛋白质成分。 从SDS-PAGE胶图上看，所得到的操纵子结合蛋白无论在55℃和75℃之间相比，还是在三个不同操纵子之间相比，它们的银染图像基本接近，这表明样本之间DNA-蛋白质结合的复合物类型基本相似;而55℃样本的胶带染色密度普遍高于75℃。我们利用ESI质谱，检测了所有染色胶带中的蛋白质成分。结果显示，55℃和75℃下的蛋白质提取液共享6个DNA结合蛋白质。在55℃和75℃样本中分别含有3个温度特异的染色带和1个操纵子特异的染色带，经质谱鉴定为DNA聚合酶α亚基、铁硫中心蛋白、特异性整合酶-解离酶和转录反终止因子。我们利用胰蛋白酶随机消化和质谱分析的方法能够鉴定更多的DNA结合蛋白质。55℃下，在三个操纵子共鉴定33个共同蛋白质，其中在操纵子片段2036、2070和2086分别鉴定了44、141和123个蛋白质;75℃下，三个操纵子共鉴定21个共同蛋白质，其中在操纵子片段2036、2070和2086分别鉴定了27、59和90个蛋白质。尽管无论在55℃还是在75℃下，操纵子2036所鉴定到的蛋白质种类明显低于操纵子2070和2086，但它所含有共享蛋白质的总MS/MS谱图数与其它两个操纵子基本一致。55℃下，三个操纵子共有蛋白质中78％属于DNA结合蛋白;75℃下，三个操纵子共有蛋白质中76％的蛋白质为DNA结合蛋白;而在两个温度下三个操纵子共享蛋白质有13个，其中85％是DNA结合蛋白质。既然操纵子之间具有共同的DNA结合蛋白，那么三个操纵子就可能共享相近的温度调机制。我们比较了SDS-PAGE和随机消化所鉴定的DNA结合蛋白质，发现SDS-PAGE胶带中所能鉴定的蛋白质在胰蛋白酶随机消化中均能检测得到，这说明SDS-PAGE胶图上主要呈现的是高丰度的DNA结合蛋白质。进一步分析SDS-PAGE和随机消化所共有的蛋白质的总肽段MS/MS总数，我们观察到55℃的MS/MS谱图数显著高于75℃，这个结果与SDS-PAGE的染色结果相当一致。综合以上分析，我们首次测定了56K区域内三个操纵子的DNA结合蛋白组，发现了三个操纵子之间以及三个操纵子在两个温度条件下均共享着一些DNA结合蛋白，初步地证实了腾冲嗜热厌氧菌中温度依赖性的基因表达受到相同分子机制调控的假设。