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目的:选取中药材人参主要有效成分总皂苷为原料,通过控制正交水热反应条件(反应温度,反应时间,反应浓度),得到不同的人参碳点产物溶液。研究其理化性质变化随反应条件的变化,总结其变化规律,探索研究其生物活性和药用功效,以期获得具有荧光标记功能和优良生物活性的人参纳米药物产物人参碳纳米点(碳点)。
方法:1.人参碳点制备工艺的探索筛选研究:以人参重要有效成分人参总皂苷为反应原料,以反应温度,反应时间,反应浓度为变量,控制不同水热反应条件,得到一系列不同条件制备的产物溶液。采用0.22μm滤膜对溶液粗过滤处理后,再通过超滤装置进行分离、纯化,得到人参碳点产物。
2.采用紫外吸收光谱、荧光光谱方法对不同反应条件下获得的产物溶液进行动态跟踪表征。根据分析跟踪表征结果,筛选出一种具有典型理化性质的人参碳点产物,确定其反应条件。
3.人参碳点理化性质的表征:应用傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)和三重四级杆-液相色谱质谱联用仪(TSQ)的测定,结合紫外吸收光谱(UV)、荧光光谱方法(PL)、高分辨透射电镜测试(TEM)结果解释推测其结构。
4.人参碳点的生物活性研究:采用CCK-8法,针对不同种类细胞如大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)、人宫颈癌细胞(HeLa细胞)、人肝癌细胞(HepG2细胞)、人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)考察人参碳点的生物活性;采用荧光成像技术,以制备的人参碳点为荧光探针,进行细胞的荧光成像实验;使用凋亡试剂盒及流式细胞仪检测人参碳点对细胞的凋亡情况。
结果:1.以人参总皂苷作为碳源,控制正交水热反应条件,一步水热法制备出了一系列不同的人参碳点产物。通过对人参碳点溶液进行紫外图谱和荧光谱图动态跟踪分析,筛选出一种具有典型理化性质的人参碳点产物,确定其反应条件:人参总皂苷的反应浓度为1.5 mg/mL,反应温度170℃,反应时间8 h。
2.经过膜过滤,超滤纯化处理后,将人参碳点产物进行UV、PL、TEM表征分析,结果显示制备的人参碳点具有一定的荧光发射性质,且尺寸分布均匀、平均粒径为4.13±0.50 nm,分散度较好,聚集较少。
3. FTIR光谱表征分析证明,人参碳点的表面富含一定的羟基结构,有利于其后续通过官能团与生物体进行有效的相互作用。质谱解析发现,制备的人参碳纳米点内仍含有人参皂苷Rg1、人参皂苷F2、人参皂苷Rd的结构,说明人参碳点的主体是由人参皂苷结合而成,不仅尺寸在纳米级,同时可能保有人参的生物活性。
4.细胞活性实验证明制备的人参碳点在50μg/mL-150μg/mL的浓度范围内对SH-SY5Y细胞具有特异的抑制作用;另一方面,人参碳点可作为荧光探针被SH-SY5Y细胞摄取。实验结果证实,与细胞作用的时间越长(8 h),碳点被细胞的摄入量越大,被荧光标记的细胞越多,细胞内显示的荧光强度越强;此外,与空白对照组进行比较,人参碳点溶液对SH-SY5Y细胞的总凋亡率明显升高。
结论:在一定条件下通过水热法所制备出的人参碳点,尺寸小,分布均匀,表面基团丰富,具有良好的碳点荧光性能,可作为一种有效的细胞荧光探针;且人参碳点的主体由人参皂苷结合而成,显示出较好的生物活性,表现出对SH-SY5Y细胞的特异细胞抑制作用,为后续中药纳米药物的制备和开发提供了良好的研究基础以及应用前景。
方法:1.人参碳点制备工艺的探索筛选研究:以人参重要有效成分人参总皂苷为反应原料,以反应温度,反应时间,反应浓度为变量,控制不同水热反应条件,得到一系列不同条件制备的产物溶液。采用0.22μm滤膜对溶液粗过滤处理后,再通过超滤装置进行分离、纯化,得到人参碳点产物。
2.采用紫外吸收光谱、荧光光谱方法对不同反应条件下获得的产物溶液进行动态跟踪表征。根据分析跟踪表征结果,筛选出一种具有典型理化性质的人参碳点产物,确定其反应条件。
3.人参碳点理化性质的表征:应用傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)和三重四级杆-液相色谱质谱联用仪(TSQ)的测定,结合紫外吸收光谱(UV)、荧光光谱方法(PL)、高分辨透射电镜测试(TEM)结果解释推测其结构。
4.人参碳点的生物活性研究:采用CCK-8法,针对不同种类细胞如大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)、人宫颈癌细胞(HeLa细胞)、人肝癌细胞(HepG2细胞)、人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)考察人参碳点的生物活性;采用荧光成像技术,以制备的人参碳点为荧光探针,进行细胞的荧光成像实验;使用凋亡试剂盒及流式细胞仪检测人参碳点对细胞的凋亡情况。
结果:1.以人参总皂苷作为碳源,控制正交水热反应条件,一步水热法制备出了一系列不同的人参碳点产物。通过对人参碳点溶液进行紫外图谱和荧光谱图动态跟踪分析,筛选出一种具有典型理化性质的人参碳点产物,确定其反应条件:人参总皂苷的反应浓度为1.5 mg/mL,反应温度170℃,反应时间8 h。
2.经过膜过滤,超滤纯化处理后,将人参碳点产物进行UV、PL、TEM表征分析,结果显示制备的人参碳点具有一定的荧光发射性质,且尺寸分布均匀、平均粒径为4.13±0.50 nm,分散度较好,聚集较少。
3. FTIR光谱表征分析证明,人参碳点的表面富含一定的羟基结构,有利于其后续通过官能团与生物体进行有效的相互作用。质谱解析发现,制备的人参碳纳米点内仍含有人参皂苷Rg1、人参皂苷F2、人参皂苷Rd的结构,说明人参碳点的主体是由人参皂苷结合而成,不仅尺寸在纳米级,同时可能保有人参的生物活性。
4.细胞活性实验证明制备的人参碳点在50μg/mL-150μg/mL的浓度范围内对SH-SY5Y细胞具有特异的抑制作用;另一方面,人参碳点可作为荧光探针被SH-SY5Y细胞摄取。实验结果证实,与细胞作用的时间越长(8 h),碳点被细胞的摄入量越大,被荧光标记的细胞越多,细胞内显示的荧光强度越强;此外,与空白对照组进行比较,人参碳点溶液对SH-SY5Y细胞的总凋亡率明显升高。
结论:在一定条件下通过水热法所制备出的人参碳点,尺寸小,分布均匀,表面基团丰富,具有良好的碳点荧光性能,可作为一种有效的细胞荧光探针;且人参碳点的主体由人参皂苷结合而成,显示出较好的生物活性,表现出对SH-SY5Y细胞的特异细胞抑制作用,为后续中药纳米药物的制备和开发提供了良好的研究基础以及应用前景。