论文部分内容阅读
目的：阿尔茨海默症（Alzheimer’s Disease，AD）是一种老年性神经致死疾病，目前我国患有AD的人数越来越多，给社会带来了严重的影响与负担，前期研究发现，人参糖肽成分（Panax ginseng glycopeptide，PGG）能够改善小鼠学习和记忆功能，但其构效关系以及组织分布情况未有报道。本文对PGG进行分离纯化、结构鉴定、构效关系分析、荧光标记和组织分布研究，并为提高生物利用度，将其制备成滴丸，为开发治疗AD药物奠定基础。
方法：（1）采用水煎法提取PGG，并利用超滤、透析进行纯化。（2）采用苯酚硫酸法，间羟基联苯法，Lowry法对PGG进行理化性质分析。（3）采用高效液相色谱法（High performance liquid chromatography，HPLC）测定PGG分子量分布。（4）采用HPLC法测定PGG单糖和氨基酸组成。（5）采用甲基化法分析PGG糖苷键连接方式。（6）采用半制备液相对PGG进行进一步纯化。（7）采用MTT法和Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞活力及其抗凋亡活性。（8）采用LC-MS/MS法对PGG进行结构分析。（9）采用异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate，FITC）对PGG进行荧光标记，采用荧光分光光度法和活体动物成像系统检测PGG在各组织的分布情况。（10）采用单因素考察和正交实验确定PGG滴丸最佳制备工艺，采用差示扫描量热分析和红外分光光度法对PGG滴丸进行结构表征。
结果：（1）PGG通过纯化得到PGG-1，PGG-2，PGG-3三部分样品。（2）PGG，PGG-1，PGG-2，PGG-3中性糖含量分别为45.4%，15.2%，11.2%，14.5%；酸性糖含量分别为4.3%，7.6%，7.9%，8.5%；蛋白质含量分别为51.1%；28.2%，9.4%，95.3%。（3）PGG，PGG-1，PGG-2，PGG-3重均分子量分别为7892Da，4443Da，3409Da，16650Da。（4）PGG由Gal、Glc、Man、Rha、Fuc、GalA、GlcNAc、GalNAc组成；PGG-1由GalA、GlcA、Glc、GlcNAc、GalNAc、Fuc组成；PGG-2由GalA、Glc、GlcNAc、GalNAc、Fuc组成；PGG-3由GalA、GlcA、Glc、GlcNAc组成。（5）PGG由Thr、Asp、Ser、Ala、Gly、Val、Leu、Phe、Ile、Glu、His、Lys、Met、Arg组成。（6）PGG主链部分是由→4)-Rha-(1→,→4)-Fuc-(1→,→6)-Gal-(1→,→4)-GalA-(1→,→4)-GlcNAc-(1→,→4)-GalNAc-(1→组成，支链主要由→3,6)-Man-(1→组成，末端主要由1→)-Fuc,1→)-Glc,1→)-GlcNAc或者1→)-GalNAc组成。（7）各组分均具有细胞保护与抗凋亡活性，其中PGG和PGG-3作用较为显著。（8）PGG具有较短的肽链和较长的糖链，PGG-3具有较长的肽链和较短的糖链，并且糖基化位点较多，与PGG相比，PGG-3具有较高的稳定性，热稳定性以及较强的疏水性。（9）小鼠脑中PGG-3-FITC含量显著高于FITC（P<0.05），显示出脑靶向趋势。（10）PGG-3滴丸的最佳制备工艺：基质为PEG4000，药物与基质比为1:4，滴速为60d/min。
结论：明确了PGG细胞保护与抗凋亡活性的构效关系；通过荧光标记手段解决了PGG体内示踪问题，并明确了其组织分布情况；通过固体分散体技术将PGG制备成滴丸，为开发治疗AD药物奠定基础。
方法：（1）采用水煎法提取PGG，并利用超滤、透析进行纯化。（2）采用苯酚硫酸法，间羟基联苯法，Lowry法对PGG进行理化性质分析。（3）采用高效液相色谱法（High performance liquid chromatography，HPLC）测定PGG分子量分布。（4）采用HPLC法测定PGG单糖和氨基酸组成。（5）采用甲基化法分析PGG糖苷键连接方式。（6）采用半制备液相对PGG进行进一步纯化。（7）采用MTT法和Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞活力及其抗凋亡活性。（8）采用LC-MS/MS法对PGG进行结构分析。（9）采用异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate，FITC）对PGG进行荧光标记，采用荧光分光光度法和活体动物成像系统检测PGG在各组织的分布情况。（10）采用单因素考察和正交实验确定PGG滴丸最佳制备工艺，采用差示扫描量热分析和红外分光光度法对PGG滴丸进行结构表征。
结果：（1）PGG通过纯化得到PGG-1，PGG-2，PGG-3三部分样品。（2）PGG，PGG-1，PGG-2，PGG-3中性糖含量分别为45.4%，15.2%，11.2%，14.5%；酸性糖含量分别为4.3%，7.6%，7.9%，8.5%；蛋白质含量分别为51.1%；28.2%，9.4%，95.3%。（3）PGG，PGG-1，PGG-2，PGG-3重均分子量分别为7892Da，4443Da，3409Da，16650Da。（4）PGG由Gal、Glc、Man、Rha、Fuc、GalA、GlcNAc、GalNAc组成；PGG-1由GalA、GlcA、Glc、GlcNAc、GalNAc、Fuc组成；PGG-2由GalA、Glc、GlcNAc、GalNAc、Fuc组成；PGG-3由GalA、GlcA、Glc、GlcNAc组成。（5）PGG由Thr、Asp、Ser、Ala、Gly、Val、Leu、Phe、Ile、Glu、His、Lys、Met、Arg组成。（6）PGG主链部分是由→4)-Rha-(1→,→4)-Fuc-(1→,→6)-Gal-(1→,→4)-GalA-(1→,→4)-GlcNAc-(1→,→4)-GalNAc-(1→组成，支链主要由→3,6)-Man-(1→组成，末端主要由1→)-Fuc,1→)-Glc,1→)-GlcNAc或者1→)-GalNAc组成。（7）各组分均具有细胞保护与抗凋亡活性，其中PGG和PGG-3作用较为显著。（8）PGG具有较短的肽链和较长的糖链，PGG-3具有较长的肽链和较短的糖链，并且糖基化位点较多，与PGG相比，PGG-3具有较高的稳定性，热稳定性以及较强的疏水性。（9）小鼠脑中PGG-3-FITC含量显著高于FITC（P<0.05），显示出脑靶向趋势。（10）PGG-3滴丸的最佳制备工艺：基质为PEG4000，药物与基质比为1:4，滴速为60d/min。
结论：明确了PGG细胞保护与抗凋亡活性的构效关系；通过荧光标记手段解决了PGG体内示踪问题，并明确了其组织分布情况；通过固体分散体技术将PGG制备成滴丸，为开发治疗AD药物奠定基础。