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黄酮类化合物是广泛存在于自然界中的一类多酚化合物,其抗肿瘤活性是目前研究的热点之一。研究发现,多种黄酮类化合物可通过多种机制产生抗肿瘤作用,其中影响肿瘤细胞周期是其重要机制之一。
首都医科大学附属北京中医医院肿瘤科从临床有确切疗效的方药“固本抑瘤Ⅱ号”(为本院内部制剂,批准文号为:京药制字Z20053351)中,经逐步拆方筛选,发现养血活血中药“鸡血藤”具有抑制肿瘤活性,并成功的分离纯化出富含黄酮类化合物的有效部位SSCE。我们的前期研究结果显示,鸡血藤黄酮类有效部位SSCE对多种肿瘤细胞系均显示出增殖抑制作用,流式细胞学检测证实其具有细胞周期阻滞作用,因此调控细胞周期有可能是鸡血藤活性成分的主要抗癌机制之一,值得深入研究,其作用靶点可能为细胞周期调控的核心分子细胞周期蛋白依赖激酶(CDKs),及其抑制分子CKI。本实验通过研究SSCE对人肺腺癌A549细胞增殖及细胞周期的影响、从基因水平及蛋白水平观察SSCE对CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、p21、p27、p57表达的影响,阐明SSCE对A549细胞周期阻滞作用的分子机制,从分子水平揭示鸡血藤抗肿瘤作用的机制之一。实验用低、中、高剂量(依次为40mg/L、80mg/L、160mg/L)SSCE分别培养A549细胞24、48、72小时后收取细胞,以完全培养液培养相同时间的A549细胞作对照,采用CCK-8法检测对细胞增殖的影响,流式细胞术检测对细胞周期的影响。结果发现低、中、高剂量SSCE依次作用于A549细胞24、48、72小时后,均可不同程度抑制细胞增殖,相同作用时间条件下,抑制率与药物浓度呈正相关,各浓度组间抑制率差异具有统计学意义(P<0.05)。低剂量SSCE作用24、48、72小时后A549细胞各期百分比较对照组无统计学意义(P>0.05)；中剂量SSCE作用24小时后A549细胞同时发生G0/G1期阻滞及G2/M期阻滞,作用48及72小时后A549细胞仅发生G2/M期阻滞；高剂量SSCE作用24小时后A549细胞同时发生G0/G1期阻滞及G2/M期阻滞,作用48及72小时后A549细胞仅发生G2/M期阻滞；相同处理时间条件下,低、中、高剂量组间G2/M期百分比差异有统计学意义(P<0.05),细胞周期阻滞率与药物浓度呈正相关。
同时我们运用RT-PCR方法检测了高剂量SSCE对A549细胞CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、p21、p27、p57 mRNA表达的影响,Wewtern-blot方法检测了高剂量SSCE对A549细胞CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、p21、p27蛋白表达量的影响。RT-PCR结果发现,高剂量SSCE作用24小时后,细胞内CDK1、CDK2、CDK6 mRNA表达较对照组减少,差异有统计学意义(P<0.05),p21 mRNA表达较对照组增加,差异有统计学意义(P<0.05),CDK4、p27、p57 mRNA表达与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；高剂量SSCE作用48小时后,细胞内CDK1 mRNA表达较对照组减少,差异有统计学意义(P<0.05),CDK2、4、、6、p21、p27、p57 mRNA表达与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。Western-blot结果发现,高剂量SSCE作用24小时后,细胞内CDK1、CDK2、CDK6蛋白含量较对照组低,差异有统计学意义(P<0.05),p21蛋白含量较对照组高,差异有统计学意义(P<0.05),CDK4、p27蛋白含量与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；高浓度SSCE作用48小时后,细胞内CDK1蛋白含量较对照组低,差异有统计学意义(P<0.05),CDK2、4、6、p21、p27蛋白含量与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。
因此,鸡血藤黄酮类有效部位SSCE可明显抑制A549细胞增殖,细胞周期阻滞作用是其机制之一,不同时间组中,SSCE对A549增殖抑制作用与药物浓度呈正相关,对细胞G2/M期阻滞率亦与药物浓度呈正相关,其中低剂量SSCE在各时间组均未出现细胞周期阻滞作用,提示低剂量SSCE可能通过其它途径抑制细胞增殖,有待进一步研究。高浓度SSCE作用A549细胞24小时后,除出现G2/M期阻滞,还出现G0/G1期阻滞,说明该作用呈时间特异性,可能与细胞周期进程有关,其机制有待进一步研究。
通过应用RT-PCR法及Western-blot法对A549细胞内CDK1、2、4、6、p21、p27、p57 mRNA及蛋白表达水平的研究,我们发现:SSCE通过下调CDK1、CDK2、CDK6 mRNA和蛋白表达,上调p21 mRNA和蛋白表达可能是引起A549细胞G0/G1阻滞的分子机制之一；下调CDK1 mRNA及蛋白表达水平可能是引起A549细胞G2/M期阻滞的分子机制之一。