论文部分内容阅读
目的:肾脏纤维化,是慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）的常见结果,其形态学特征包括肾小管间质纤维化（tubulointerstitial fibrosis,TIF,又称肾间质纤维化,renal interstitial fibrosis,RIF）和肾小球硬化,通常RIF比肾小球硬化更严重,且更早地发生,是促进肾脏疾病进展的重要因素。肾脏损伤后,组织持续缺血缺氧,引发持续性炎症,诱导大量的成纤维细胞促进因子和炎症因子的释放,同时促进大量免疫细胞激活进一步损伤肾组织,继而导致肾脏纤维化,并逐渐进展为终末期肾病（end-stage renal disease,ESRD）。流行病学研究表明,全球ESRD患者的患病率逐年增加。因此,亟需寻找RIF的有效策略。在RIF过程中,NK细胞（natural killer cells）发挥重要作用。NK细胞作为先天免疫细胞,参与炎症反应调节网络。其无需依赖特定的适应性免疫反应激活,而是通过配体结合细胞表面相应受体激活其免疫活性。NK细胞激活后,可直接释放细胞毒性颗粒,合成和分泌γ型干扰素（interferon-γ,IFN-γ,一种II型干扰素）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα,TNF-α）等细胞因子,作用于肾小管上皮细胞,促进了RIF和慢性肾病进展。STING/TBK1/IRF3通路为激活先天免疫的重要通路之一,最早在癌症免疫环境中被发现,STING作为一种关键信号蛋白,可识别非自我、来自病毒以及细菌等病原生物的产物,也能够识别体内自我损伤的相关分子,激活下游的TANK结合激酶1（TANK-binding kinase 1,TBK1）以及干扰素调节因子3（interferon regulatory factor 3,IRF3）和核因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）,促发I型干扰素以及激活NK细胞等免疫反应。有研究发现药物抑制STING能够减少IFN-γ等细胞因子的释放减轻RIF,这种IFN-γ释放的减少很可能与NK细胞的激活相关。本研究关注抑制STING对于RIF的影响,深入研究STING/TBK1/IRF3参与RIF进程的具体机制,探究RIF过程中NK细胞激活与该通路的关系。旨在以此增进对RIF潜在的发病机制的认识,为临床治疗及新药研发提供理论基础和潜在靶点。研究方法:1.检测STING抑制剂对小鼠RIF的作用。1.1采用腹腔注射叶酸（FA）造模方式建立小鼠RIF模型（FA组）,腹腔注射STING抑制剂C176（FA+C176组）,检测小鼠血清中血尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）的水平;1.2对小鼠肾组织进行H＆E、PAS、Masson染色,并进行肾脏病理损伤程度评分;1.3采用Western blot、q RT-PCR、免疫组化等方法检测组织α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、IV型胶原蛋白（COL-IV）、纤连蛋白（FN）等促纤维化分子在m RNA及蛋白水平的表达情况;1.4 ELISA法检测TNF-α、IFN-γ、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素10（IL-10）等炎症因子以及趋化因子2（CCL2）等趋化因子的蛋白水平变化以及q RTPCR法检测其m RNA水平变化。2.明确RIF中存在NK细胞激活。2.1通过生物信息学分析,分别对人类RIF与正常肾脏组织转录组数据的差异基因进行统计,对差异基因分别进行基因本体（GO）富集分析及京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析以及基因集富集分析（GSEA）,探索RIF过程中的调控机制;2.2使用免疫荧光多重染色实验观察并比较人RIF组织标本和正常肾脏组织标本中NK细胞标记物CD56和细胞激活标志物CD69以及IFN-γ的空间定位及表达水平,检测RIF中激活的NK细胞是IFN-γ的重要来源。3.探索STING抑制剂影响NK细胞激活进而调控肾小管上皮细胞损伤的作用机制。3.1免疫荧光多重染色实验检测不同组小鼠肾脏NK细胞的激活以及IFN-γ释放情况;3.2检测损伤的肾小管上皮细胞（HK-2）对NK细胞的影响。利用TGF-β诱导24 h致HK-2细胞损伤以构建细胞纤维化模型,收集其条件培养基（CM）,将不同处理条件的NK细胞暴露于CM。应用Western blot、q RT-PCR技术检测NK细胞激活标记物CD69以及IFN-γ的表达及释放情况;3.3应用q RT-PCR、Western blot技术检测NK细胞中STING、TBK1、IRF3的转录及翻译水平;免疫荧光多重染色检测不同组小鼠肾组织中NK细胞标记物CD161和细胞激活标志物CD69以及STING的空间定位及表达水平;3.4探索NK细胞对损伤的HK-2细胞的影响。将TGF-β诱导24 h后的HK-2细胞暴露于不同处理条件的NK细胞的CM,应用q RT-PCR与Western blot方法检测α-SMA、COL-IV、FN等纤维化相关蛋白在m RNA及蛋白水平的表达变化。结果:1.STING抑制剂能够减轻RIF。1.1 STING抑制剂C176可以保护FA诱导的RIF模型小鼠的肾功能:相较于NC组,FA组中BUN、Scr显著更高（P＜0.05）,而C176处理可显著改善这种趋势（P＜0.05）;1.2 STING抑制剂可以减轻RIF模型小鼠肾脏的损伤性病理改变:通过H＆E、PAS染色对肾组织进行损伤评分,发现NC组肾脏无明显损伤,FA组肾损伤评分最高（P＜0.05）,FA+C176组损伤次之（P＜0.05）;1.3 STING抑制剂可以减缓小鼠RIF病变进展:Masson染色可见FA组肾组织纤维化程度严重,RIF标志物α-SMA、COL-IV、FN的m RNA和蛋白表达水平显著高于NC组（P＜0.05）,而FA+C176组的相应指标显著低于FA组（P＜0.05）;1.4 STING抑制剂可以降低RIF模型小鼠多种炎症因子与趋化因子的表达水平:FA组TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10及CCL2的m RNA和蛋白表达水平显著高于NC组（P＜0.05）,而FA+C176组的相应指标显著低于FA组（P＜0.05）。2.NK细胞激活参与RIF进程。2.1通过分析RIF转录组,筛选出存在表达差异的594个基因,其中上调基因134个,下调基因460个。GO功能富集分析显示,差异基因主要在免疫细胞受体等信号通路中富集。其中,IL2RB基因显著下调,该基因的缺失能够抑制T细胞活性而对NK细胞活性影响甚微。提示在RIF中可能存在T细胞活性抑制而NK细胞活性增强的情况。结合IFN-γ（主要来源于激活的NK和T细胞）在RIF小鼠中过表达情况,提示NK细胞可能参与RIF进程;2.2免疫荧光多重染色显示,RIF患者肾组织活检标本中存在NK细胞标志物CD56和激活标志物CD69共表达,及CD56和IFN-γ共表达,且表达强度显著高于正常肾组织。提示与正常肾组织相比,纤维化的肾组织中NK细胞激活水平及IFN-γ表达水平相对升高。3.STING抑制剂通过抑制NK细胞激活进而减轻RIF。3.1 STING抑制剂可减少RIF模型小鼠肾组织的NK细胞激活:免疫荧光多重染色结果显示,FA组小鼠肾脏组织中NK细胞标记物CD161以及激活标志物CD69较NC组相对高表达,而FA+C176组相对于FA组CD161与CD69相对低表达。提示STING抑制剂可下调RIF小鼠肾组织中的NK细胞激活及IFN-γ的表达水平;3.2体外实验中,STING抑制剂可减少NK细胞的激活:本研究所设置条件下,将NK细胞暴露于TGF-β诱导的HK-2细胞的CM并培养24 h。结果显示NK+CM组NK细胞激活标记物CD69及IFN-γ的m RNA以及蛋白表达水平较NK组显著更高（P＜0.05）,而加入H-151（NK+CM+H151组）后CD69以及IFN-γ的m RNA以及蛋白表达水平较NK+CM组显著更低（P＜0.05）。提示损伤的HK-2细胞能够诱导NK细胞激活,而H151可下调NK细胞激活及IFN-γ的表达水平;3.3 STING抑制剂通过抑制STING/TBK1/IRF3信号通路下调NK细胞激活水平:结果显示NK+CM组STING及磷酸化的TBK1、IRF3表达水平较NK组显著升高（P＜0.05）,而NK+CM+H151组相应指标水平较NK+CM组显著更低（P＜0.05）,提示H151可抑制该通路的激活。此外,小鼠肾脏组织多重荧光染色结果显示,在小鼠肾组织中,NC组NK细胞活化水平较低,FA组NK细胞活化水平较NC组显著更高,而FA+C176组中NK细胞的活化水平较FA显著更低,NK细胞中的STING表达与其活化趋势相一致;3.4 STING抑制剂通过抑制NK细胞激活下调HK-2细胞纤维化相关指标的表达:首先利用TGF-β诱导HK-2细胞24 h,以构建纤维化细胞模型,再暴露于NK细胞的CM并培养24 h后,结果显示HK-2+NK组较HK-2组α-SMA、COL-IV、FN在m RNA及蛋白水平均显著更高（P＜0.05）,HK-2+NK+H151组相应指标水平较HK-2+NK组显著更低（P＜0.05）。提示NK细胞可加重细胞纤维化程度,而STING抑制剂可减轻这种损伤。结论:1.STING抑制剂可保护FA诱导的RIF小鼠肾功能,减轻肾损伤及RIF的病理变化,同时可减少多种炎症因子及趋化因子的表达。2.激活的NK细胞及其释放的IFN-γ等炎症因子参与了RIF进程。3.STING抑制剂可通过抑制STING/TBK1/IRF3通路下调NK细胞激活水平,并可能介此减轻肾小管上皮细胞损伤,延缓RIF。