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系统性硬皮病(systemic scleroderma SSc)是以过量胶原在皮肤、肺、消化道等内脏器官沉积为特征的结缔组织疾病,可引起皮肤和内脏器官纤维化。目前,西医尚缺乏满意疗法。我科临床实践表明,对SSc患者硬化期采用益气活血方、活动期采用清热活血方均取得了良好疗效,但其作用机制尚未完全清楚。本课题将我科验方的主要药物按功效拆方为活血方、益气方、清热方。从细胞水平研究了活血方、益气方、清热方对SSc患者成纤维细胞增殖、胶原合成的影响,以探讨临床验方可能的作用机制,为临床组方提供理论依据。
第一部分：活血方、益气方、清热方对SScFb形态及增殖的影响
目的：观察活血方、益气方、清热方对SScFb形态及增殖的影响。
方法：1.原代培养SScFb两株。2.实验分为5组：活血方组、益气方组、清热方组、阳性对照组(青霉胺)、阴性对照组(生理盐水)。3.按实验分组制备各组大鼠血清。4.倒置显微镜下分别观察活血方、益气方、清热方药物血清不同浓度(5％、10％、20％),不同时间(24h、72h、144h)作用下对SScFb形态的影响,并与阳性对照组和阴性对照组比较,以及进行中药组间比较。5.CCK-8法分析活血方、益气方、清热方药物血清不同浓度(5％、10％、20％),不同时间(24h、72h、144h)作用下对SScFb增殖的影响,并与阳性对照组和阴性对照组比较,以及进行中药组间比较。
结果：1.与阴性对照组比较,随着浓度的增加、作用时间的延长,活血方、益气方、清热方药物血清对SScFb形态均有生长抑制作用。与阳性对照组比较,活血方药物血清表现出与青霉胺药物血清相似程度的生长抑制,益气方和清热方药物血清对SScFb的抑制现象则不如青霉胺药物血清明显。2.与阴性对照组比较,当药物血清浓度为10％和20％,在24h、72h、144h时,活血方、益气方、清热方药物血清均可显著抑制SScFb增殖(P<0.05),呈剂量效应和时间效应关系。与阳性对照组比较,活血方药物血清抑制作用与青霉胺药物血清无显著差异(P>0.05),益气方、清热方药物血清抑制作用不及青霉胺药物血清,且差异有统计学意义(P<0.05),但益气方药物血清与活血方药物血清抑制作用差异无统计学意义(P>0.05)。
结论：活血方、益气方、清热方对SScFb形态和增殖均有有明显抑制作用,呈剂量效应关系和时间效应关系。其中活血方抑制作用与青霉胺相似,且优于益气方和清热方。
第二部分：活血方、益气方、清热方对SScFb胶原合成的影响
目的：研究活血方、益气方、清热方对SScFb胶原蛋白合成的影响。
方法：体外培养的SScFb按实验分组分别加入不同浓度(5％、10％、20％)的活血方、益气方、清热方、青霉胺药物血清及阴性对照组大鼠血清,作用24h、72h、144h后,采用羟脯氨酸试剂盒法测各组细胞培养上清液中羟脯氨酸含量,并折算成胶原蛋白含量。
结果：与阴性对照组比较,浓度为10％和20％的活血方、益气方、清热方药物血清,在作用72h、144h时,活血方、益气方、清热方药物血清均可显著抑制SScFb胶原合成(P<0.05),并呈浓度依赖性关系。与阳性对照组比较,活血方药物血清抑制作用与青霉胺药物血清无显著差异(P>0.05),益气方、清热方药物血清抑制作用不及青霉胺药物血清,且差异有统计学意义(P<0.05),但益气方药物血清与活血方药物血清抑制作用差异无统计学意义(P>0.05)。
结论：在一定浓度和作用时间下,活血方、益气方、清热方能抑制SScFb胶原合成,呈浓度依赖性关系。其中活血方抑制作用与青霉胺相似,且优于益气方和清热方。