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目的:
1.初步分析高脂血症人群的临床特征并探寻高脂血症与非高脂血症对照人群外周血单核细胞的基因表达谱特征,筛选与高脂血症形成相关的差异表达基因,并深入探讨与其相关的细胞生物功能和信号通路;
2.初步分析高脂血症不同体质人群的临床特征并探寻高脂血症不同体质人群血清中差异表达的miRNAs,深入探寻高脂血症不同中医体质形成及其与动脉粥样硬化性疾病相关的信号通路。
方法:
第一部分研究方法:研究采用的是横断面研究设计,于2017年对广东省村落地区人群进行筛查,根据纳入和排除标准,运用简单随机抽样方法,最终纳入20例高脂血症及19例非高脂血症对照人群,对所有受试者进行临床生化检测,收集人口学资料及临床资料进行临床特征分析。对临床数据资料采用SPSS软件(version17,SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)分析。由于本研究总样本量为39,即n＜40,对性别、吸烟史、饮酒史及体质类型等定性料则用Fisher精确概率法,以均值和百分比(N(％))表示;对于年龄、体重指数及临床生化指标等计量资料,满足正态分布且方差齐性检验则用独立样本t(Student’s t-test)检验分析,以均数和标准差(mean±SD)表示,若满足正态分布但方差不齐时则采用t’检验,若不符合正态分布的计量资料则用非参数检验,以中位数和四分位间距M(P25～P75)表示。假设检验统一使用双侧检验,均列出检验统计量及P值,以P值＜0.05作为差异有统计学意义的标准。此外,还收集所有受试者的外周血单核细胞(PBMC)样本,采用Agilent SurePrint G3Human Gene Expression v3Microarray基因芯片技术进行全基因表达检测:提取总RNA并质检,参照芯片标准流程进行反转录合成eDNA,再进一步合成用Cyanine-3-CTP(Cy3)标记的cRNA,标记好的cRNA样品片段化后和芯片杂交,洗脱后利用Agilent Scanner G2505C(Agilent Technologies)扫描得到原始图像。再通过Feature Extraction软件处理原始图像提取原始数据,生成的原始数据文件经Genespring软件进行quantile标准化后进行后续的数据分析。通过表达谱芯片质控探针的中位变异系数值(Median CV)和样本的检出率,结合芯片数据箱线图对基因芯片实验及数据进行质控。采用样本聚类分析、样本相关性分析及主成分分析(PCA)对PBMC样本芯片数据进行分组评估,剔除极端离群样本,进一步对生物样本进行质控和筛选,纳入具有生物学重复性的样本,最终纳入19例高脂血症和8例非高脂血症对照组人群的基因芯片数据进行后续基因表达谱分析。对芯片数据的分析,采用Fold-change(表达差异倍数)以及T检验(Student’s t-test)统计学方法进行差异基因筛选,依据fold change≥2或≤0.5且P＜0.05的筛选标准确定高脂血症及非高脂血症对照组人群间的差异表达基因。并用散点图,火山图和聚类分层图对差异表达基因筛选结果进行直观展示。再运用DAVID6.8.在线平台对差异表达基因进行GO(Gene Ontology)功能注释和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析。并参考String数据库,利用cytoscape软件(Version3.7.2)分别绘制上调基因间和下调基因间相互作用网络图。最后结合文献,挑选表达差异倍数较大且差异具有统计学意义的基因进行验证,依据本研究高脂血症和非高脂血症对照组的纳入和排除标准,通过随机抽样方法,再次纳入研究对象,进一步扩大样本量,收集受试者的PBMC样本,提取总RNA,利用qRT-PCR(Quantitative Real-time-PCR)方法对选取的差异表达基因进行验证。
第二部分研究方法:研究采用的是横断面研究设计,运用分层抽样的方法,于2017年对广东村落地区人群进行筛查,根据诊断、纳入和排除标准筛选出347例高脂血症病例,依据体质类型进行分层,其中高脂血症平和质234例、高脂血症实性体质53例及虚性体质60例。再采用简单随机抽样的方法从高脂血症平和质、高脂血症实性体质及虚性体质人群中各抽出10例受试者参与本研究,对所有受试者进行临床生化检测,收集人口学资料及临床资料并进行分析。对三组不同体质高脂血症人群的临床数据资料的比较,采用SPSS软件(version17,SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)分析。由于本研究中总样本量为24,n＜40,对于性别、吸烟史、饮酒史、糖尿病史、高尿酸血症病史、慢性炎症性疾病史及慢性肾功能不全病史等定性资料的比较采用Fisher精确概率法,并用Bonferroni法校正P值对分布差异的变量进行两两比较,以均值和百分比(N(％))表示;连续性变量符合正态分布则采用方差分析,并用Bonferroni法进行多重比较,以均数和标准差(mean±SD)表示。假设检验统一使用双侧检验,列出检验统计量及P值,以P值＜0.05作为差异有统计学意义的标准。并收集每例受试者的血清样本,提取总RNA并进行质控,运用qPCR原理,使用针对miRNA的反转录试剂盒QIAGEN miScriptⅡRT Kit对提取的总RNA进行反转录形成cDNA,运用miScript miRNA PCR Array芯片并结合miScript SYBR Green PCR Kit按照生产厂商规定的标准操作流程进行qPCR试验,检测miRNA表达,得到miRNA PCR Array芯片数据。用R软件的princomp函数进行主成分(PCA)分析筛选生物芯片样本,剔除极端离群样本,进一步对生物样本进行质控和筛选,纳入具有生物学重复性的样本,最终分别纳入高脂血症平和质9例、实性体质7例及虚性体质8例样本的miRNA芯片数据进行后续miRNA表达差异性分析。将miRNA PCR array检测的原始数据导入QIAGEN公司提供的在线平台(QIAGEN3.5),采用中位值对miRNA芯片原始信号值进行标准化后,进行差异表达miRNA分析及靶基因预测。计算两两组的每个基因的2(-Avg.(Delta(Ct)),采用Fold-change(表达差异倍数)以及,检验(Student’s t-test)统计学方法对差异表达miRNA进行筛选,计算Fold change值和P值。依据Fold change≥2或≤0.5且P＜0.05作为确定组问差异表达miRNA的标准。样本聚类分析是采用层次聚类,以欧式距离作为聚类指标。对每组差异筛选结果绘制散点图,火山图和聚类分层图。用DAVID6.8在线平台对靶基因进行KEGG pathway富集分析;用Venny分析在线平台对特定差异表达miRNA进行维恩分析;并根据KEGG数据库,利用cytoscape软件(VersiOn3.7.2)分别绘制miRNA与富集通路之问的相互作用网络图。
结果:
第一部分研究结果:高脂血症与非高脂血症对照组临床资料分析结果显示,两组之间性别、吸烟史、饮酒史及体质类型的分布差异无统计学意义(P＜0.05);高脂血症人群比非高脂血症对照人群年龄及体重指数偏高(P＜0.05),且高脂血症人群中超敏C反应蛋白及血糖水平均较高(P＜0.05)。其他促甲状腺激素、游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离四碘甲状腺原氨酸(FT4)、降钙素原、血白细胞数、血红细胞数、血小板、肾小球滤过率、血红蛋白量、血尿酸、血肌酐等在两组间的差异无统计学意义(P＞0.05)。
基因芯片数据分析结果显示高脂血症与非高脂血症人群PBMC样本基因表达谱具有明显差异性,共检测出4795差异表达基因,其中在高脂血症组中有2101个基因表达上调,2694个基因表达下调。对差异表达基因进行GO功能注释及KEGG通路富集分析,结果显示共富集了3242条失调的G0功能和18条KEGG信号通路,根据P值由小到大的顺序筛选出前40位的G0条目,分子功能相关的条目主要涉及到趋化因子受体活性(chemokine receptor activity)、G蛋白偶联趋化因子受体活性(G-protein coupled chemoattractant receptor activity)等;细胞组成主要涉及特异性颗粒内腔(specifiC granule lumen)等;生物学过程主要涉及到趋化因子介导信号通路(chemokine-mediated signaling pathway)、中性粒细胞激活(neutrophil aetivation)、中性粒细胞介导的免疫(neutrophi mediatedimmunity)等。富集的18条KEGG信号通路主要涉及单纯疱疹病毒1型感染通路(Herpes Simplex virus1infection)、细胞因子受体相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)等。富集显著的GO生物功能和KEGG信号通路大部分均与感染免疫和炎症相关,提示高脂血症形成的分子机制可能主要与免疫炎症相关的生物功能和信号通路失调相关。
通过扩大样本量,选取表达差异倍数较大的17个基因利用qRT-PCR方法进行验证,结果显示ATP1A1、DFNB31、FAM53B、HBEGF、MAPK14、PIK3CB、ABCA1基因在高脂血症与对照组中表达差异性具有统计学意义(P＜O.05)。根据基因功能和通路富集分析结果显示这些差异表达基因可能参与高脂血症形成的生物过程包括:ATPlAl调控的机械刺激反应(response to mechanical stimulus)、FAM53B正向调控Wnt信号通路、ABCA1调控环嘌呤核苷酸代谢过程(cyclic purine nucleotide metabolic process)、HBEGF调控上皮细胞迁移(epithelial cell migration)。
第二部分研究结果:高脂血症平和质组、实性体质组和虚性体质组三组临床资料分析结果显示,糖尿病史、高尿酸血症病史、FT3、血尿酸水平、血白细胞计数、血红细胞数及血红蛋白量在三组中的差异具有统计学意义(P＜0.05)。对定性资料利用Bonferroni法校正检验效能,将糖尿病和高尿酸血症病史采用Fisher精确概率法进行两两比较,结果表明高脂血症实性体质患者比高脂血症虚性体质和平和质患者更常伴有糖尿病和高尿酸血症(P＜0.05)。对定量资料FT3、血尿酸水平、血白细胞计数、血红细胞数及血红蛋白量采用Bonferroni法进行方差分析多重比较,结果显示高脂血症虚性体质血FT3水平较其他两种体质均显著降低(P＜0.05),提示血FT3水平下降可能是高脂血症虚性体质人群特征性表现之一;高脂血症虚性体质组血红细胞数及白细胞数均较平和质组低(P＜0.05);高脂血症虚性体质组血红蛋白量较实性体质组低(P＜0.05);高脂血症实性体质组血尿酸水平较虚性体质组升高(P＜0.05)。
结论:
1.年老、高体重指数、高水平的超敏C反应蛋白及血糖可能是高脂血症形成的危险因素;高脂血症和非高脂血症对照人群PBMC样本之间基因表达特征存在明显的差异性,这些差异性基因可能是通过调控免疫炎性相关生物功能和信号通路参与高脂血症的形成和发展过程;
2.ATP1A1、DFNB31、FAM53B、HBEGF、MAPK14、PIK3CB、ABCA1基因参与调控的生物过程可能是高脂血症形成的分子机制之一;
3.高脂血症三种不同中医体质人群间存在明显的差异表达miRNA,其中hsa-miR-338-3p可能是鉴别高脂血症实性体质,虚性体质和平和质潜在的血清分子标志物,且可能通过负调控免疫炎性及糖脂质代谢等相关通路参与高脂血症患者形成动脉粥样硬化性血管疾病过程;
4.hsa-miR-145-5p、hsa-miR-183-3p、hsa-miR-210-3p可能是鉴别高脂血症虚性体质潜在的血清分子标志物;
5.高脂血症实性体质人群存在多种促进动脉粥样硬化性疾病的危险因素包括糖尿病、高尿酸血症及hsa-miR-338-3p表达下调,实性体质可能是高脂血症人群易感动脉粥样硬化性疾病的预警因子。
1.初步分析高脂血症人群的临床特征并探寻高脂血症与非高脂血症对照人群外周血单核细胞的基因表达谱特征,筛选与高脂血症形成相关的差异表达基因,并深入探讨与其相关的细胞生物功能和信号通路;
2.初步分析高脂血症不同体质人群的临床特征并探寻高脂血症不同体质人群血清中差异表达的miRNAs,深入探寻高脂血症不同中医体质形成及其与动脉粥样硬化性疾病相关的信号通路。
方法:
第一部分研究方法:研究采用的是横断面研究设计,于2017年对广东省村落地区人群进行筛查,根据纳入和排除标准,运用简单随机抽样方法,最终纳入20例高脂血症及19例非高脂血症对照人群,对所有受试者进行临床生化检测,收集人口学资料及临床资料进行临床特征分析。对临床数据资料采用SPSS软件(version17,SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)分析。由于本研究总样本量为39,即n＜40,对性别、吸烟史、饮酒史及体质类型等定性料则用Fisher精确概率法,以均值和百分比(N(％))表示;对于年龄、体重指数及临床生化指标等计量资料,满足正态分布且方差齐性检验则用独立样本t(Student’s t-test)检验分析,以均数和标准差(mean±SD)表示,若满足正态分布但方差不齐时则采用t’检验,若不符合正态分布的计量资料则用非参数检验,以中位数和四分位间距M(P25～P75)表示。假设检验统一使用双侧检验,均列出检验统计量及P值,以P值＜0.05作为差异有统计学意义的标准。此外,还收集所有受试者的外周血单核细胞(PBMC)样本,采用Agilent SurePrint G3Human Gene Expression v3Microarray基因芯片技术进行全基因表达检测:提取总RNA并质检,参照芯片标准流程进行反转录合成eDNA,再进一步合成用Cyanine-3-CTP(Cy3)标记的cRNA,标记好的cRNA样品片段化后和芯片杂交,洗脱后利用Agilent Scanner G2505C(Agilent Technologies)扫描得到原始图像。再通过Feature Extraction软件处理原始图像提取原始数据,生成的原始数据文件经Genespring软件进行quantile标准化后进行后续的数据分析。通过表达谱芯片质控探针的中位变异系数值(Median CV)和样本的检出率,结合芯片数据箱线图对基因芯片实验及数据进行质控。采用样本聚类分析、样本相关性分析及主成分分析(PCA)对PBMC样本芯片数据进行分组评估,剔除极端离群样本,进一步对生物样本进行质控和筛选,纳入具有生物学重复性的样本,最终纳入19例高脂血症和8例非高脂血症对照组人群的基因芯片数据进行后续基因表达谱分析。对芯片数据的分析,采用Fold-change(表达差异倍数)以及T检验(Student’s t-test)统计学方法进行差异基因筛选,依据fold change≥2或≤0.5且P＜0.05的筛选标准确定高脂血症及非高脂血症对照组人群间的差异表达基因。并用散点图,火山图和聚类分层图对差异表达基因筛选结果进行直观展示。再运用DAVID6.8.在线平台对差异表达基因进行GO(Gene Ontology)功能注释和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析。并参考String数据库,利用cytoscape软件(Version3.7.2)分别绘制上调基因间和下调基因间相互作用网络图。最后结合文献,挑选表达差异倍数较大且差异具有统计学意义的基因进行验证,依据本研究高脂血症和非高脂血症对照组的纳入和排除标准,通过随机抽样方法,再次纳入研究对象,进一步扩大样本量,收集受试者的PBMC样本,提取总RNA,利用qRT-PCR(Quantitative Real-time-PCR)方法对选取的差异表达基因进行验证。
第二部分研究方法:研究采用的是横断面研究设计,运用分层抽样的方法,于2017年对广东村落地区人群进行筛查,根据诊断、纳入和排除标准筛选出347例高脂血症病例,依据体质类型进行分层,其中高脂血症平和质234例、高脂血症实性体质53例及虚性体质60例。再采用简单随机抽样的方法从高脂血症平和质、高脂血症实性体质及虚性体质人群中各抽出10例受试者参与本研究,对所有受试者进行临床生化检测,收集人口学资料及临床资料并进行分析。对三组不同体质高脂血症人群的临床数据资料的比较,采用SPSS软件(version17,SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)分析。由于本研究中总样本量为24,n＜40,对于性别、吸烟史、饮酒史、糖尿病史、高尿酸血症病史、慢性炎症性疾病史及慢性肾功能不全病史等定性资料的比较采用Fisher精确概率法,并用Bonferroni法校正P值对分布差异的变量进行两两比较,以均值和百分比(N(％))表示;连续性变量符合正态分布则采用方差分析,并用Bonferroni法进行多重比较,以均数和标准差(mean±SD)表示。假设检验统一使用双侧检验,列出检验统计量及P值,以P值＜0.05作为差异有统计学意义的标准。并收集每例受试者的血清样本,提取总RNA并进行质控,运用qPCR原理,使用针对miRNA的反转录试剂盒QIAGEN miScriptⅡRT Kit对提取的总RNA进行反转录形成cDNA,运用miScript miRNA PCR Array芯片并结合miScript SYBR Green PCR Kit按照生产厂商规定的标准操作流程进行qPCR试验,检测miRNA表达,得到miRNA PCR Array芯片数据。用R软件的princomp函数进行主成分(PCA)分析筛选生物芯片样本,剔除极端离群样本,进一步对生物样本进行质控和筛选,纳入具有生物学重复性的样本,最终分别纳入高脂血症平和质9例、实性体质7例及虚性体质8例样本的miRNA芯片数据进行后续miRNA表达差异性分析。将miRNA PCR array检测的原始数据导入QIAGEN公司提供的在线平台(QIAGEN3.5),采用中位值对miRNA芯片原始信号值进行标准化后,进行差异表达miRNA分析及靶基因预测。计算两两组的每个基因的2(-Avg.(Delta(Ct)),采用Fold-change(表达差异倍数)以及,检验(Student’s t-test)统计学方法对差异表达miRNA进行筛选,计算Fold change值和P值。依据Fold change≥2或≤0.5且P＜0.05作为确定组问差异表达miRNA的标准。样本聚类分析是采用层次聚类,以欧式距离作为聚类指标。对每组差异筛选结果绘制散点图,火山图和聚类分层图。用DAVID6.8在线平台对靶基因进行KEGG pathway富集分析;用Venny分析在线平台对特定差异表达miRNA进行维恩分析;并根据KEGG数据库,利用cytoscape软件(VersiOn3.7.2)分别绘制miRNA与富集通路之问的相互作用网络图。
结果:
第一部分研究结果:高脂血症与非高脂血症对照组临床资料分析结果显示,两组之间性别、吸烟史、饮酒史及体质类型的分布差异无统计学意义(P＜0.05);高脂血症人群比非高脂血症对照人群年龄及体重指数偏高(P＜0.05),且高脂血症人群中超敏C反应蛋白及血糖水平均较高(P＜0.05)。其他促甲状腺激素、游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离四碘甲状腺原氨酸(FT4)、降钙素原、血白细胞数、血红细胞数、血小板、肾小球滤过率、血红蛋白量、血尿酸、血肌酐等在两组间的差异无统计学意义(P＞0.05)。
基因芯片数据分析结果显示高脂血症与非高脂血症人群PBMC样本基因表达谱具有明显差异性,共检测出4795差异表达基因,其中在高脂血症组中有2101个基因表达上调,2694个基因表达下调。对差异表达基因进行GO功能注释及KEGG通路富集分析,结果显示共富集了3242条失调的G0功能和18条KEGG信号通路,根据P值由小到大的顺序筛选出前40位的G0条目,分子功能相关的条目主要涉及到趋化因子受体活性(chemokine receptor activity)、G蛋白偶联趋化因子受体活性(G-protein coupled chemoattractant receptor activity)等;细胞组成主要涉及特异性颗粒内腔(specifiC granule lumen)等;生物学过程主要涉及到趋化因子介导信号通路(chemokine-mediated signaling pathway)、中性粒细胞激活(neutrophil aetivation)、中性粒细胞介导的免疫(neutrophi mediatedimmunity)等。富集的18条KEGG信号通路主要涉及单纯疱疹病毒1型感染通路(Herpes Simplex virus1infection)、细胞因子受体相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)等。富集显著的GO生物功能和KEGG信号通路大部分均与感染免疫和炎症相关,提示高脂血症形成的分子机制可能主要与免疫炎症相关的生物功能和信号通路失调相关。
通过扩大样本量,选取表达差异倍数较大的17个基因利用qRT-PCR方法进行验证,结果显示ATP1A1、DFNB31、FAM53B、HBEGF、MAPK14、PIK3CB、ABCA1基因在高脂血症与对照组中表达差异性具有统计学意义(P＜O.05)。根据基因功能和通路富集分析结果显示这些差异表达基因可能参与高脂血症形成的生物过程包括:ATPlAl调控的机械刺激反应(response to mechanical stimulus)、FAM53B正向调控Wnt信号通路、ABCA1调控环嘌呤核苷酸代谢过程(cyclic purine nucleotide metabolic process)、HBEGF调控上皮细胞迁移(epithelial cell migration)。
第二部分研究结果:高脂血症平和质组、实性体质组和虚性体质组三组临床资料分析结果显示,糖尿病史、高尿酸血症病史、FT3、血尿酸水平、血白细胞计数、血红细胞数及血红蛋白量在三组中的差异具有统计学意义(P＜0.05)。对定性资料利用Bonferroni法校正检验效能,将糖尿病和高尿酸血症病史采用Fisher精确概率法进行两两比较,结果表明高脂血症实性体质患者比高脂血症虚性体质和平和质患者更常伴有糖尿病和高尿酸血症(P＜0.05)。对定量资料FT3、血尿酸水平、血白细胞计数、血红细胞数及血红蛋白量采用Bonferroni法进行方差分析多重比较,结果显示高脂血症虚性体质血FT3水平较其他两种体质均显著降低(P＜0.05),提示血FT3水平下降可能是高脂血症虚性体质人群特征性表现之一;高脂血症虚性体质组血红细胞数及白细胞数均较平和质组低(P＜0.05);高脂血症虚性体质组血红蛋白量较实性体质组低(P＜0.05);高脂血症实性体质组血尿酸水平较虚性体质组升高(P＜0.05)。
结论:
1.年老、高体重指数、高水平的超敏C反应蛋白及血糖可能是高脂血症形成的危险因素;高脂血症和非高脂血症对照人群PBMC样本之间基因表达特征存在明显的差异性,这些差异性基因可能是通过调控免疫炎性相关生物功能和信号通路参与高脂血症的形成和发展过程;
2.ATP1A1、DFNB31、FAM53B、HBEGF、MAPK14、PIK3CB、ABCA1基因参与调控的生物过程可能是高脂血症形成的分子机制之一;
3.高脂血症三种不同中医体质人群间存在明显的差异表达miRNA,其中hsa-miR-338-3p可能是鉴别高脂血症实性体质,虚性体质和平和质潜在的血清分子标志物,且可能通过负调控免疫炎性及糖脂质代谢等相关通路参与高脂血症患者形成动脉粥样硬化性血管疾病过程;
4.hsa-miR-145-5p、hsa-miR-183-3p、hsa-miR-210-3p可能是鉴别高脂血症虚性体质潜在的血清分子标志物;
5.高脂血症实性体质人群存在多种促进动脉粥样硬化性疾病的危险因素包括糖尿病、高尿酸血症及hsa-miR-338-3p表达下调,实性体质可能是高脂血症人群易感动脉粥样硬化性疾病的预警因子。