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目的：
1.分离、培养小鼠BMSCs，探讨虎杖苷对BMSCs向神经元样细胞定向分化潜能的影响，并筛选虎杖苷在体外实验的工作浓度，为进一步实验奠定基础。
2.建立小鼠脊髓损伤动物模型，通过分组干预，探讨虎杖苷对移植BMSCs在体内脊髓伤区中向神经分化的作用。
3.应用小鼠BMSCs神经诱导分化体系和脊髓损伤动物模型，探讨虎杖苷-Nrf2/ARE轴在BMSCs向神经分化中的调控机制。
4.对比虎杖苷灌胃、BMSCs定点移植、虎杖苷灌胃联合BMSCs移植在小鼠脊髓损伤模型中的治疗效果，通过行为学评价、神经功能检查、组织病理学检测等加以明确。
方法：
1.虎杖苷对BMSCs在体外向神经分化的影响
(1)BMSCs的分离、培养、传代及鉴定从C57BL/6小鼠肱骨、股骨、胫骨中提取原代BMSCs，并进行培养、传代。通过成骨诱导、成软骨诱导及相关特异性染色检测细胞的多向分化潜能;流式细胞术检测小鼠BMSCs表面标记物。
(2)虎杖苷对BMSCs活性及向神经分化潜能的影响
CCK-8检测不同浓度虎杖苷对BMSCs活性的影响，筛选虎杖苷工作浓度用于神经诱导分化实验，并在镜下动态观察各组细胞形态变化。
(3)虎杖苷对神经诱导分化BMSCs中神经标志物表达的影响
①WB、RT-qPCR和免疫荧光染色分别检测对照组、标准诱导组和各虎杖苷组(3、10、30μmol/l)中MAP-2、NeuN、NF-M和NSE的蛋白、mRNA及荧光表达;
②WB检测对照组和30μmol/l虎杖苷组中DBH、ChAT、GAD65和TH的蛋白表达。
2.虎杖苷对移植BMSCs在体内向神经分化的影响
(1)BMSCs的标记
复苏冻存的BMSCs，待细胞汇合度达70％时，加入BrdU标记48h，免疫荧光染色检测细胞标记率。
(2)动物分组、造模、干预及取材
①125只8周龄C57BL/6小鼠随机分为5组(每组25只)：假手术组(Sham组)、模型组(SCI组)、虎杖苷组(PD组)、干细胞移植组(BMSCs组)、虎杖苷联合干细胞移植组(PD+BMSCs组);
②建立T10节段脊髓损伤动物模型，根据分组情况进行干预;
③分别在造模后第7、10及28天取下含损伤节段的新鲜脊髓组织，保存于-80℃备用;造模后第28天取脊髓组织，固定24h，梯度脱水后行冰冻切片。
(3)脊髓组织样品检测
①免疫荧光染色检测脊髓伤区BrdU/Nestin、BrdU/NeuN和BrdU/NSE双阳性表达情况，WB检测造模28天后脊髓伤区中Nestin、NeuN和NSE蛋白表达;
②WB检测造模7天后脊髓组织iNOS、NF-κB蛋白表达，采用ELISA检测IL-6、IL-1β和TNF-α蛋白表达;
③分别检测造模7、10天后脊髓组织中SOD、MDA含量。
3.虎杖苷-Nrf2/ARE轴在BMSCs向神经分化中的调控机制
(1)细胞实验
①细胞分组干预;
第一部分实验，分为5组：对照组、标准诱导组、虎杖苷组(3、10、30μmol/l);第二部分实验，分为5组：对照组、标准诱导组、抑制剂组(100nmol/l鸦胆子苦醇)、虎杖苷组(30μmol/l)、虎杖苷+抑制剂组。
②探讨虎杖苷促进BMSCs在体外向神经元样细胞分化的潜在调控通路;
WB检测第一部分实验各组细胞PI3K-AKT、MAPK及Nrf2/ARE信号通路相关蛋白的表达，RT-qPCR检测Notch、Wnt、BMP/Smad及Nrf2/ARE信号通路相关基因的mRNA表达。
③探讨虎杖苷-Nrf2/ARE轴对BMSCs在体外向神经分化的影响。
WB、RT-qPCR和免疫荧光染色分别检测中第二部分实验各组细胞MAP-2、NeuN、NF-M和NSE的蛋白、mRNA及荧光表达。
(2)动物实验
①动物分组及干预;
第一部分实验，共5组(每组7只)，分组情况同上述2.;第二部分实验，共4组(每组7只)：假手术组(Sham组)、模型组(SCI组)、虎杖苷联合干细胞移植组(PD+BMSCs组)、联合治疗+抑制剂组(PD+BMSCs+Bru组)。造模后根据分组情况进行干预，在造模28天后取材。
②探讨不同干预方式对体内Nrf2/ARE通路表达的影响;
免疫荧光染色检测第一部分实验各组脊髓组织中Nrf2的荧光表达，WB检测Nrf2/ARE通路相关蛋白的表达。
③探讨虎杖苷-Nrf2/ARE轴对BMSCs在体内向神经分化的影响。
免疫荧光染色检测PD+BMSCs组和PD+BMSCs+Bru组脊髓伤区BrdU/Nestin、BrdU/NeuN和BrdU/NSE双阳性表达情况，WB检测第二部分实验各组脊髓中Nestin、NeuN和NSE蛋白表达。
4.虎杖苷联合BMSCs移植在脊髓损伤中的疗效探讨
(1)动物分组、造模、干预及取材
参照上述2.进行动物分组、造模及干预，在造模28天后取材。
(2)行为学评价
通过BBB评分标准和斜板实验对各组小鼠后肢运动功能恢复情况进行评估。
结果：
1.虎杖苷对BMSCs在体外向神经分化的影响
提取的BMSCs具有多向分化潜能，且纯度较高。根据CCK-8结果，虎杖苷在3、10、30μmol/l浓度时对细胞活性较好，故选取该浓度范围用于神经诱导分化实验。显微镜下观察发现，虎杖苷组细胞在诱导中后期的神经样细胞数目明显多于标准诱导组。WB和PCR结果显示，与标准诱导组相比，虎杖苷在体外呈浓度依赖性上调细胞中神经标志物MAP-2、NeuN、NF-M和NSE的蛋白和mRNA表达(P＜0.05)。且虎杖苷对NF-M和ChAT的荧光表达强度、MAP-2和NeuN的荧光阳性表达率也有促进作用(P＜O.05)，在30μmol/l浓度时效果最为显著(P＜0.05)。
2.虎杖苷对移植BMSCs在体内向神经分化的影响
本研究建立的脊髓损伤小鼠模型具有较高的稳定性和可复制性。免疫荧光染色结果显示，造模4周后可在体内检测到BrdU标记的外源性BMSCs，部分细胞同时共表达Nestin、NeuN或NSE。与BMSCs组相比，PD+BMSCs组小鼠脊髓中能检测到更多BrdU/神经标志物双阳性的移植细胞(P＜O.05)。WB结果表明各种治疗方式均能上调脊髓中Nestin、NeuN和NSE的蛋白表达，但PD+BMSCs组表达更高(P＜O.05)，接近于Sham组水平。各治疗组小鼠脊髓中炎症相关因子表达量、氧化应激相关指标含量比较均无统计学差异(P＞0.05)。
3.虎杖苷-Nrf2/ARE轴在BMSCs向神经分化中的调控机制
(1)细胞实验中，与标准诱导组相比，虎杖苷组细胞中PI3K-AKT和MAPK信号通路相关蛋白的表达及Notch、Wnt和BMP/Smad信号通路相关基因的mRNA表达差异均无统计学意义(P＞0.05)。但虎杖苷组中Nrf2、NQO-1和HO-1的蛋白和mRNA表达较标准诱导组显著上调(P＜O.05)。在阻断Nrf2/ARE信号通路后，虎杖苷上调细胞中神经标志物蛋白及mRNA表达的作用被抑制，表达水平明显低于虎杖苷组(P＜0.05)，免疫荧光实验结果的趋势与之相类似。
(2)动物实验中，与SCI组相比，各治疗组中Nrf2的荧光表达强度及Nrf2/ARE信号通路相关蛋白的表达均显著提高(P＜0.05)，PD+BMSCs组水平高于其余治疗组(P＜0.05)。与PD+BMSCs组相比，在阻断Nrf2/ARE信号通路后，PD+BMSCs+Bru组小鼠体内移植BMSCs向神经分化的效率显著降低(P＜0.05)，且Nestin、NeuN和NSE的蛋白表达亦明显下调(P＜0.05)。
4.虎杖苷联合BMSCs移植在脊髓损伤中的疗效探讨
在造模后14～28天期间，与其余治疗组相比，PD+BMSCs组小鼠BBB评分及斜板实验临界角度更高(P＜0.05)。神经电生理检查表明，治疗后小鼠的SCEP较SCI组有明显恢复(P＜0.05)，而PD+BMSCs组波幅更大、潜伏期更短(P＜0.05)。组织病理学实验中，PD+BMSCs组小鼠脊髓组织损伤表面积明显小于其余治疗组和SCI组(P＜0.05)，HE染色和Nissl染色也表明该组脊髓损伤程度更轻(P＜O.05)。与其余脊髓损伤小鼠相比，PD+BMSCs组轴突髓鞘修复及轴突新生相关的指标表达增高(P＜0.05)，而胶质瘢痕形成相关的指标则表达降低(P＜0.05)。
结论：
1.在神经诱导分化培养液基础上，虎杖苷呈浓度依赖性地促进BMSCs在体外分化为(胆碱能)神经元样细胞，其中30μmol/l浓度时效果最显著，并且虎杖苷还能促进移植BMSCs在体内向神经元样细胞分化。而上述效应可能是通过Nrf2/ARE通路的激活而实现的。
2.虎杖苷灌胃联合BMSCs移植能有效改善脊髓损伤小鼠后肢运动功能障碍，并促进脊髓神经功能恢复，这可能是基于其促进脊髓伤区轴突髓鞘修复，加速轴突新生，并减缓胶质瘢痕对神经纤维生长的遮挡效应而发挥作用的。
1.分离、培养小鼠BMSCs，探讨虎杖苷对BMSCs向神经元样细胞定向分化潜能的影响，并筛选虎杖苷在体外实验的工作浓度，为进一步实验奠定基础。
2.建立小鼠脊髓损伤动物模型，通过分组干预，探讨虎杖苷对移植BMSCs在体内脊髓伤区中向神经分化的作用。
3.应用小鼠BMSCs神经诱导分化体系和脊髓损伤动物模型，探讨虎杖苷-Nrf2/ARE轴在BMSCs向神经分化中的调控机制。
4.对比虎杖苷灌胃、BMSCs定点移植、虎杖苷灌胃联合BMSCs移植在小鼠脊髓损伤模型中的治疗效果，通过行为学评价、神经功能检查、组织病理学检测等加以明确。
方法：
1.虎杖苷对BMSCs在体外向神经分化的影响
(1)BMSCs的分离、培养、传代及鉴定从C57BL/6小鼠肱骨、股骨、胫骨中提取原代BMSCs，并进行培养、传代。通过成骨诱导、成软骨诱导及相关特异性染色检测细胞的多向分化潜能;流式细胞术检测小鼠BMSCs表面标记物。
(2)虎杖苷对BMSCs活性及向神经分化潜能的影响
CCK-8检测不同浓度虎杖苷对BMSCs活性的影响，筛选虎杖苷工作浓度用于神经诱导分化实验，并在镜下动态观察各组细胞形态变化。
(3)虎杖苷对神经诱导分化BMSCs中神经标志物表达的影响
①WB、RT-qPCR和免疫荧光染色分别检测对照组、标准诱导组和各虎杖苷组(3、10、30μmol/l)中MAP-2、NeuN、NF-M和NSE的蛋白、mRNA及荧光表达;
②WB检测对照组和30μmol/l虎杖苷组中DBH、ChAT、GAD65和TH的蛋白表达。
2.虎杖苷对移植BMSCs在体内向神经分化的影响
(1)BMSCs的标记
复苏冻存的BMSCs，待细胞汇合度达70％时，加入BrdU标记48h，免疫荧光染色检测细胞标记率。
(2)动物分组、造模、干预及取材
①125只8周龄C57BL/6小鼠随机分为5组(每组25只)：假手术组(Sham组)、模型组(SCI组)、虎杖苷组(PD组)、干细胞移植组(BMSCs组)、虎杖苷联合干细胞移植组(PD+BMSCs组);
②建立T10节段脊髓损伤动物模型，根据分组情况进行干预;
③分别在造模后第7、10及28天取下含损伤节段的新鲜脊髓组织，保存于-80℃备用;造模后第28天取脊髓组织，固定24h，梯度脱水后行冰冻切片。
(3)脊髓组织样品检测
①免疫荧光染色检测脊髓伤区BrdU/Nestin、BrdU/NeuN和BrdU/NSE双阳性表达情况，WB检测造模28天后脊髓伤区中Nestin、NeuN和NSE蛋白表达;
②WB检测造模7天后脊髓组织iNOS、NF-κB蛋白表达，采用ELISA检测IL-6、IL-1β和TNF-α蛋白表达;
③分别检测造模7、10天后脊髓组织中SOD、MDA含量。
3.虎杖苷-Nrf2/ARE轴在BMSCs向神经分化中的调控机制
(1)细胞实验
①细胞分组干预;
第一部分实验，分为5组：对照组、标准诱导组、虎杖苷组(3、10、30μmol/l);第二部分实验，分为5组：对照组、标准诱导组、抑制剂组(100nmol/l鸦胆子苦醇)、虎杖苷组(30μmol/l)、虎杖苷+抑制剂组。
②探讨虎杖苷促进BMSCs在体外向神经元样细胞分化的潜在调控通路;
WB检测第一部分实验各组细胞PI3K-AKT、MAPK及Nrf2/ARE信号通路相关蛋白的表达，RT-qPCR检测Notch、Wnt、BMP/Smad及Nrf2/ARE信号通路相关基因的mRNA表达。
③探讨虎杖苷-Nrf2/ARE轴对BMSCs在体外向神经分化的影响。
WB、RT-qPCR和免疫荧光染色分别检测中第二部分实验各组细胞MAP-2、NeuN、NF-M和NSE的蛋白、mRNA及荧光表达。
(2)动物实验
①动物分组及干预;
第一部分实验，共5组(每组7只)，分组情况同上述2.;第二部分实验，共4组(每组7只)：假手术组(Sham组)、模型组(SCI组)、虎杖苷联合干细胞移植组(PD+BMSCs组)、联合治疗+抑制剂组(PD+BMSCs+Bru组)。造模后根据分组情况进行干预，在造模28天后取材。
②探讨不同干预方式对体内Nrf2/ARE通路表达的影响;
免疫荧光染色检测第一部分实验各组脊髓组织中Nrf2的荧光表达，WB检测Nrf2/ARE通路相关蛋白的表达。
③探讨虎杖苷-Nrf2/ARE轴对BMSCs在体内向神经分化的影响。
免疫荧光染色检测PD+BMSCs组和PD+BMSCs+Bru组脊髓伤区BrdU/Nestin、BrdU/NeuN和BrdU/NSE双阳性表达情况，WB检测第二部分实验各组脊髓中Nestin、NeuN和NSE蛋白表达。
4.虎杖苷联合BMSCs移植在脊髓损伤中的疗效探讨
(1)动物分组、造模、干预及取材
参照上述2.进行动物分组、造模及干预，在造模28天后取材。
(2)行为学评价
通过BBB评分标准和斜板实验对各组小鼠后肢运动功能恢复情况进行评估。
结果：
1.虎杖苷对BMSCs在体外向神经分化的影响
提取的BMSCs具有多向分化潜能，且纯度较高。根据CCK-8结果，虎杖苷在3、10、30μmol/l浓度时对细胞活性较好，故选取该浓度范围用于神经诱导分化实验。显微镜下观察发现，虎杖苷组细胞在诱导中后期的神经样细胞数目明显多于标准诱导组。WB和PCR结果显示，与标准诱导组相比，虎杖苷在体外呈浓度依赖性上调细胞中神经标志物MAP-2、NeuN、NF-M和NSE的蛋白和mRNA表达(P＜0.05)。且虎杖苷对NF-M和ChAT的荧光表达强度、MAP-2和NeuN的荧光阳性表达率也有促进作用(P＜O.05)，在30μmol/l浓度时效果最为显著(P＜0.05)。
2.虎杖苷对移植BMSCs在体内向神经分化的影响
本研究建立的脊髓损伤小鼠模型具有较高的稳定性和可复制性。免疫荧光染色结果显示，造模4周后可在体内检测到BrdU标记的外源性BMSCs，部分细胞同时共表达Nestin、NeuN或NSE。与BMSCs组相比，PD+BMSCs组小鼠脊髓中能检测到更多BrdU/神经标志物双阳性的移植细胞(P＜O.05)。WB结果表明各种治疗方式均能上调脊髓中Nestin、NeuN和NSE的蛋白表达，但PD+BMSCs组表达更高(P＜O.05)，接近于Sham组水平。各治疗组小鼠脊髓中炎症相关因子表达量、氧化应激相关指标含量比较均无统计学差异(P＞0.05)。
3.虎杖苷-Nrf2/ARE轴在BMSCs向神经分化中的调控机制
(1)细胞实验中，与标准诱导组相比，虎杖苷组细胞中PI3K-AKT和MAPK信号通路相关蛋白的表达及Notch、Wnt和BMP/Smad信号通路相关基因的mRNA表达差异均无统计学意义(P＞0.05)。但虎杖苷组中Nrf2、NQO-1和HO-1的蛋白和mRNA表达较标准诱导组显著上调(P＜O.05)。在阻断Nrf2/ARE信号通路后，虎杖苷上调细胞中神经标志物蛋白及mRNA表达的作用被抑制，表达水平明显低于虎杖苷组(P＜0.05)，免疫荧光实验结果的趋势与之相类似。
(2)动物实验中，与SCI组相比，各治疗组中Nrf2的荧光表达强度及Nrf2/ARE信号通路相关蛋白的表达均显著提高(P＜0.05)，PD+BMSCs组水平高于其余治疗组(P＜0.05)。与PD+BMSCs组相比，在阻断Nrf2/ARE信号通路后，PD+BMSCs+Bru组小鼠体内移植BMSCs向神经分化的效率显著降低(P＜0.05)，且Nestin、NeuN和NSE的蛋白表达亦明显下调(P＜0.05)。
4.虎杖苷联合BMSCs移植在脊髓损伤中的疗效探讨
在造模后14～28天期间，与其余治疗组相比，PD+BMSCs组小鼠BBB评分及斜板实验临界角度更高(P＜0.05)。神经电生理检查表明，治疗后小鼠的SCEP较SCI组有明显恢复(P＜0.05)，而PD+BMSCs组波幅更大、潜伏期更短(P＜0.05)。组织病理学实验中，PD+BMSCs组小鼠脊髓组织损伤表面积明显小于其余治疗组和SCI组(P＜0.05)，HE染色和Nissl染色也表明该组脊髓损伤程度更轻(P＜O.05)。与其余脊髓损伤小鼠相比，PD+BMSCs组轴突髓鞘修复及轴突新生相关的指标表达增高(P＜0.05)，而胶质瘢痕形成相关的指标则表达降低(P＜0.05)。
结论：
1.在神经诱导分化培养液基础上，虎杖苷呈浓度依赖性地促进BMSCs在体外分化为(胆碱能)神经元样细胞，其中30μmol/l浓度时效果最显著，并且虎杖苷还能促进移植BMSCs在体内向神经元样细胞分化。而上述效应可能是通过Nrf2/ARE通路的激活而实现的。
2.虎杖苷灌胃联合BMSCs移植能有效改善脊髓损伤小鼠后肢运动功能障碍，并促进脊髓神经功能恢复，这可能是基于其促进脊髓伤区轴突髓鞘修复，加速轴突新生，并减缓胶质瘢痕对神经纤维生长的遮挡效应而发挥作用的。