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土壤盐碱化是一个世界性的问题,现在进行盐碱地开发的有效途径是培育新型的耐盐植物品系.草业可持续发展是我国经济实现可持续发展的重要保证,而开展抗旱、耐盐碱牧草和草坪草育种则是我国草业发展的重大技术需求.高羊茅是目前国内外广泛应用的冷季型草坪草之一,营养价值极高,具有耐瘠薄、抗锈病、适应性强等特性,但高羊茅叶片粗糙、生长缓慢、耐盐性差及易受杂草危害等缺点.采用常规育种方法对它们进行种质改良不仅周期长、成效低,而且缺乏必要的遗传背景知识.利用基因工程技术改良高羊茅耐盐性,对保持草坪四季常绿,扩大建植区域和改善生态环境均具有十分重要的意义.本论文在分析高羊茅胚性愈伤组织植株再生和农杆菌介导遗传转化的多种影响因素的基础上,将耐盐性相关的SOS途径基因(SOS1,SOS2,SOS3和SCaBP8)遗传转化高羊茅基因组中,并获得耐盐性增强的转基因植株.主要研究结果如下:
(1)对成熟种子愈伤组织诱导、胚性愈伤组织继代和分化的影响因素进行了研究,构建了高频的高羊茅胚性愈伤组织植株再生体系.研究表明,在2,4-D为5.5 mg/L时愈伤组织诱导率达67%,诱导出的愈伤组织多数呈现浅黄色、结构致密、颗粒状;2.0 mg/L 6-BA+1.O mg/L KT最适合愈伤组织分化,分化率最高可达到69.87%;在IBA浓度为0.3 mgL-l,蔗糖浓度为20 g/L的生根培养基中,生根率可以达到l00%,生根所需时间也较短.实验还发现,高羊茅成熟种子愈伤组织诱导特别是胚性愈伤组织形成及植株再生存在明显的品种间差异.
(2)确定了农杆菌介导高羊茅胚性愈伤组织转化的适宜条件,建立了高羊茅高效遗传转化体系.在农杆菌介导高羊茅遗传转化中,宜选用头孢霉素作为抑菌剂,其浓度以500 mg/L较为合适;采用1张滤纸进行共培养3d的效果最好;PPT筛选浓度5 mg.L-l;最适浸染农杆菌菌液OD600值为0.6左右;浸染时间以20 min较为合适;添加乙酰丁香酮浓度以100 μmoI.L-l最为适宜.
(3)采用所建立的农杆菌介导转化体系,首次将耐盐相关拟南芥SOS途径基因(SOS1,SOS2,SOS3和SCaBP8)导入高羊茅品种爱瑞3号的基因组中,经PCR检测、Southern blotting、RT-PCR和活体叶片PPT抗性鉴定分析,获得独立来源的转基因植株.
(4)借助非损伤微测技术,分别测定了盐胁迫(350 mM NaCl)下野生型和转基因株系6-2根系的Na+、K+和Ca2+的离子流速及Na+、K+含量.结果表明,盐胁迫(350 mM NaCl)下,SOS1+ SOS2+ SOS3和SCaBP8过表达的转基因植株比野生型植株根系积累较少的Na+,较多的K+,呈现了较低的Na+/K+耐盐特性,这可能是由于SOS途径基因调控了Na+在植物体内的动态平衡,即SOS途径基因的共表达可以使Na+从高羊茅的根和叶细胞排出,减轻Na+的毒性影响,提高转基因高羊茅的耐盐性.此外,盐胁迫下,转基因植株中的Ca2+涌入的平均速率明显高于野生型植株,较高的Ca2+水平可以保证细胞膜的完整性,维持细胞内较高的K+/Na+,促进K+的选择性吸收,说明Ca2+转运可能和SOS途径调控耐盐性之间有关系.由于转基因植株根系较低的Na+/K+,导致在盐胁迫(350 mM NaCl)下,野生型和转基因株系6-2之间有明显的表型差异,即野生型植株表现出生长迟缓、叶片发黄,而转基因植株生长正常.
(5)为研究耐盐多基因转化与转基因植株的生物学效应,分别在盐土和碱土两种类型盐碱地上对转基因植株进行了农艺性状、生理生化指标及土壤理化性质的测定,分析了转基因株系的不同性状表达规律及耐盐机理,探讨了不同类型盐碱地上转基因植株与环境的互作.提出了在不同类型盐碱地上,转拟南芥SOS途径基因的高羊茅具有较好的生物学整合效应.
在不同类型盐碱地,转基因植株和野生型植株的生长都受到了一定的抑制,但转基因植株的株高、叶面积、干重和生物量均显著高于同等条件下野生型植株,说明了SOS途径基因的超量表达确实提高了转基因高羊茅的农艺性状.
在盐土盐碱地和碱土盐碱地,转基因高羊茅植株叶绿素含量显著高于野生型,超量表达SOS途径基因的转基因植株比野生型植株维持更高的电子传递速率与光合速率,从而提高了转基因植株干物质的积累;盐碱胁迫条件下,对转基因植株叶中POD活性、SOD活性和脯氨酸含量的促进作用更明显,说明转基因植株清除自由基、活性氧和积累脯氨酸的能力增强;转基因株系6-2和6-3与野生型对照相比,在盐碱胁迫下MDA积累较少,说明转基因株系膜脂过氧化程度较低,膜的结构较稳定,提高了盐碱胁迫下植株细胞膜的修复能力,使转基因的植株具有较强耐盐碱性;高羊茅野生型对照叶片Na+含量都高于转基因株系,这说明在盐碱胁迫条件下,转基因高羊茅通过Na+外排来防止Na+在细胞质中大量积累,以维持细胞质中低的Na+含量,同时维持更高的K+吸收以保证高的K+/Na+比率,避免或降低盐害,从而提高高羊茅的耐盐碱能力.
田间试验结果表明,转基因高羊茅在降低土壤pH、全盐和碱化度,提高土壤含水量等方面优于野生型植株,表明转基因高羊茅能够改善土壤微环境,这种变化只是由于种植高羊茅长势差异引起的,即由于生物改良效果的差异产生了土壤理化性质变化的差异.此外,转基因植株的生理生化指标和农艺性状受到土壤微环境的影响较小,说明不同类型盐碱地上转基因植株与土壤微环境呈现良好的互作关系,即转基因高羊茅在田间具有较好的生物学整合效应.
本研究结果为我国高羊茅耐盐鉴定和耐盐机理等研究提供理论依据,为选育适合盐渍化土壤种植的耐盐高羊茅新品种,以及我国盐碱地的治理和生态环境保护建设提供技术支撑.
(1)对成熟种子愈伤组织诱导、胚性愈伤组织继代和分化的影响因素进行了研究,构建了高频的高羊茅胚性愈伤组织植株再生体系.研究表明,在2,4-D为5.5 mg/L时愈伤组织诱导率达67%,诱导出的愈伤组织多数呈现浅黄色、结构致密、颗粒状;2.0 mg/L 6-BA+1.O mg/L KT最适合愈伤组织分化,分化率最高可达到69.87%;在IBA浓度为0.3 mgL-l,蔗糖浓度为20 g/L的生根培养基中,生根率可以达到l00%,生根所需时间也较短.实验还发现,高羊茅成熟种子愈伤组织诱导特别是胚性愈伤组织形成及植株再生存在明显的品种间差异.
(2)确定了农杆菌介导高羊茅胚性愈伤组织转化的适宜条件,建立了高羊茅高效遗传转化体系.在农杆菌介导高羊茅遗传转化中,宜选用头孢霉素作为抑菌剂,其浓度以500 mg/L较为合适;采用1张滤纸进行共培养3d的效果最好;PPT筛选浓度5 mg.L-l;最适浸染农杆菌菌液OD600值为0.6左右;浸染时间以20 min较为合适;添加乙酰丁香酮浓度以100 μmoI.L-l最为适宜.
(3)采用所建立的农杆菌介导转化体系,首次将耐盐相关拟南芥SOS途径基因(SOS1,SOS2,SOS3和SCaBP8)导入高羊茅品种爱瑞3号的基因组中,经PCR检测、Southern blotting、RT-PCR和活体叶片PPT抗性鉴定分析,获得独立来源的转基因植株.
(4)借助非损伤微测技术,分别测定了盐胁迫(350 mM NaCl)下野生型和转基因株系6-2根系的Na+、K+和Ca2+的离子流速及Na+、K+含量.结果表明,盐胁迫(350 mM NaCl)下,SOS1+ SOS2+ SOS3和SCaBP8过表达的转基因植株比野生型植株根系积累较少的Na+,较多的K+,呈现了较低的Na+/K+耐盐特性,这可能是由于SOS途径基因调控了Na+在植物体内的动态平衡,即SOS途径基因的共表达可以使Na+从高羊茅的根和叶细胞排出,减轻Na+的毒性影响,提高转基因高羊茅的耐盐性.此外,盐胁迫下,转基因植株中的Ca2+涌入的平均速率明显高于野生型植株,较高的Ca2+水平可以保证细胞膜的完整性,维持细胞内较高的K+/Na+,促进K+的选择性吸收,说明Ca2+转运可能和SOS途径调控耐盐性之间有关系.由于转基因植株根系较低的Na+/K+,导致在盐胁迫(350 mM NaCl)下,野生型和转基因株系6-2之间有明显的表型差异,即野生型植株表现出生长迟缓、叶片发黄,而转基因植株生长正常.
(5)为研究耐盐多基因转化与转基因植株的生物学效应,分别在盐土和碱土两种类型盐碱地上对转基因植株进行了农艺性状、生理生化指标及土壤理化性质的测定,分析了转基因株系的不同性状表达规律及耐盐机理,探讨了不同类型盐碱地上转基因植株与环境的互作.提出了在不同类型盐碱地上,转拟南芥SOS途径基因的高羊茅具有较好的生物学整合效应.
在不同类型盐碱地,转基因植株和野生型植株的生长都受到了一定的抑制,但转基因植株的株高、叶面积、干重和生物量均显著高于同等条件下野生型植株,说明了SOS途径基因的超量表达确实提高了转基因高羊茅的农艺性状.
在盐土盐碱地和碱土盐碱地,转基因高羊茅植株叶绿素含量显著高于野生型,超量表达SOS途径基因的转基因植株比野生型植株维持更高的电子传递速率与光合速率,从而提高了转基因植株干物质的积累;盐碱胁迫条件下,对转基因植株叶中POD活性、SOD活性和脯氨酸含量的促进作用更明显,说明转基因植株清除自由基、活性氧和积累脯氨酸的能力增强;转基因株系6-2和6-3与野生型对照相比,在盐碱胁迫下MDA积累较少,说明转基因株系膜脂过氧化程度较低,膜的结构较稳定,提高了盐碱胁迫下植株细胞膜的修复能力,使转基因的植株具有较强耐盐碱性;高羊茅野生型对照叶片Na+含量都高于转基因株系,这说明在盐碱胁迫条件下,转基因高羊茅通过Na+外排来防止Na+在细胞质中大量积累,以维持细胞质中低的Na+含量,同时维持更高的K+吸收以保证高的K+/Na+比率,避免或降低盐害,从而提高高羊茅的耐盐碱能力.
田间试验结果表明,转基因高羊茅在降低土壤pH、全盐和碱化度,提高土壤含水量等方面优于野生型植株,表明转基因高羊茅能够改善土壤微环境,这种变化只是由于种植高羊茅长势差异引起的,即由于生物改良效果的差异产生了土壤理化性质变化的差异.此外,转基因植株的生理生化指标和农艺性状受到土壤微环境的影响较小,说明不同类型盐碱地上转基因植株与土壤微环境呈现良好的互作关系,即转基因高羊茅在田间具有较好的生物学整合效应.
本研究结果为我国高羊茅耐盐鉴定和耐盐机理等研究提供理论依据,为选育适合盐渍化土壤种植的耐盐高羊茅新品种,以及我国盐碱地的治理和生态环境保护建设提供技术支撑.