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豆科植物是一类典型的具有固氮共生能力的植物。在固氮共生过程中，植物宿主与根瘤菌之间进行一系列复杂的信号交流，形成了一个特殊的器官——根瘤，以此获得植物所需的氮元素。在豆科模式生物蒺藜苜蓿固氮共生过程，根瘤菌会进入植物细胞形成终极分化的类菌体。类菌体是植物固氮共生中的核心单元，通过利用植物光合作用提供的碳源合成植物所需的氮源。
近年来，研究者从豆科模式植物中，利用快中子轰击技术得到各类固氮缺失型突变体，采用图位克隆方法获得一系列参与调控固氮共生过程的关键基因。本课题组前期以固氮缺失型突变体dnf5为研究对象，发现其根部形成一个白色圆形无固氮能力的小根瘤，并检测到根瘤细胞中的类菌体分化呈现明显异常，利用图位克隆实验发现一个编码类受体蛋白激酶的基因DNF5的突变导致dnf5突变体相关突变表型的形成。基于前期研究，我们推测，DNF5是参与调控类菌体的分化的一个关键基因。因此，本论文旨在通过对DNF5蛋白结构域进行生物信息学分析并寻找其保守的氨基酸位点，并通过对保守的氨基酸位点进行基因定点突变，从而分析DNF5蛋白保守的氨基酸位点其参与类菌体分化的生物学功能，帮助解析固氮共生信号网络中的关键节点DNF5的作用机理。
具体研究结果如下：
1、生物信息学分析发现：基于前期图位克隆得到的基因缺失位点的基因序列，发现DNF5(Medtr3g079850)基因由5153个核苷酸组成，它编码一个具有655个氨基酸的类受体蛋白激酶。DNF5蛋白具有信号肽，且它具有单次跨膜域，具有两个富含半胱氨酸的结构域的胞外结构域和胞内激酶结构域。
DNF5胞外结构域中富含半胱氨酸位点，通过与其他物种同源蛋白的保守性比对分析，选择其中保守性高的6个位点，分别是C95、C98、C213、C123、C225、C251，依次编号为1-6号；DNF5激酶结构域具有典型的Mg2+结合位点、ATP结合位点，分别是K391、D484；DNF5蛋白胞内激酶区三个保守的自激活位点，分别为S521、S524、S538。
2、为了验证DNF5蛋白的胞外结构域保守的半胱氨酸位点对DNF5蛋白功能的影响，成功构建了11个DNF5-E-pointmutation-pKGWWRR载体(见附录二)，发现DNF5胞外结构域半胱氨酸位点的单突位点1、3、4、5和1、2位点的双突均能成功遗传互补dnf5；1、2、3、4位点的四突和1、2、3、4、5、6位点的六突未能成功遗传互补dnf5。由此说明，DNF5胞外结构域的保守的半胱氨酸位点影响DNF5蛋白功能的发挥，单个的半胱氨酸位点的定点突变，即破坏一对二硫键，并不能使得DNF5蛋白丧失功能。
3、成功构建了DNF5激酶结构域的Mg2+结合位点K391、ATP结合位点D484定点突变的载体：DNF5K391M-pKGWWRR、DNF5D484A-pKGWWRR，发现它们均不能够成功互补dnf5突变体，说明DNF5胞内激酶结构域激活所需要的Mg2+结合位点和ATP结合位点对DNF5整个蛋白的功能的发挥是必需的，由此推测DNF5蛋白发挥功能可能通过磷酸化激活下游底物，为详细解析DNF5蛋白信号通路提供参考。
4、为了进一步确定DNF5通过磷酸化激活下游底物，本研究开始聚焦DNF5蛋白胞内激酶区的自主激活。目前已经成功构建了3个以胞外结构域六个定点突变的DNF5为模板进行定点突变的DNF5-E-A-pointmutation-pKGWWRR载体和3个以缺失掉胞外结构域的DNF5为模板进行定点突变的DNF5-K-A-pointmutation-pKGWWRR载体。
本论文对蒺藜苜蓿DNF5蛋白结构域的功能进行了初步解析，对后续详细解析DNF5蛋白调控类菌体分化的机制提供帮助，对后续研究植物固氮共生提供新的思路参考。
近年来，研究者从豆科模式植物中，利用快中子轰击技术得到各类固氮缺失型突变体，采用图位克隆方法获得一系列参与调控固氮共生过程的关键基因。本课题组前期以固氮缺失型突变体dnf5为研究对象，发现其根部形成一个白色圆形无固氮能力的小根瘤，并检测到根瘤细胞中的类菌体分化呈现明显异常，利用图位克隆实验发现一个编码类受体蛋白激酶的基因DNF5的突变导致dnf5突变体相关突变表型的形成。基于前期研究，我们推测，DNF5是参与调控类菌体的分化的一个关键基因。因此，本论文旨在通过对DNF5蛋白结构域进行生物信息学分析并寻找其保守的氨基酸位点，并通过对保守的氨基酸位点进行基因定点突变，从而分析DNF5蛋白保守的氨基酸位点其参与类菌体分化的生物学功能，帮助解析固氮共生信号网络中的关键节点DNF5的作用机理。
具体研究结果如下：
1、生物信息学分析发现：基于前期图位克隆得到的基因缺失位点的基因序列，发现DNF5(Medtr3g079850)基因由5153个核苷酸组成，它编码一个具有655个氨基酸的类受体蛋白激酶。DNF5蛋白具有信号肽，且它具有单次跨膜域，具有两个富含半胱氨酸的结构域的胞外结构域和胞内激酶结构域。
DNF5胞外结构域中富含半胱氨酸位点，通过与其他物种同源蛋白的保守性比对分析，选择其中保守性高的6个位点，分别是C95、C98、C213、C123、C225、C251，依次编号为1-6号；DNF5激酶结构域具有典型的Mg2+结合位点、ATP结合位点，分别是K391、D484；DNF5蛋白胞内激酶区三个保守的自激活位点，分别为S521、S524、S538。
2、为了验证DNF5蛋白的胞外结构域保守的半胱氨酸位点对DNF5蛋白功能的影响，成功构建了11个DNF5-E-pointmutation-pKGWWRR载体(见附录二)，发现DNF5胞外结构域半胱氨酸位点的单突位点1、3、4、5和1、2位点的双突均能成功遗传互补dnf5；1、2、3、4位点的四突和1、2、3、4、5、6位点的六突未能成功遗传互补dnf5。由此说明，DNF5胞外结构域的保守的半胱氨酸位点影响DNF5蛋白功能的发挥，单个的半胱氨酸位点的定点突变，即破坏一对二硫键，并不能使得DNF5蛋白丧失功能。
3、成功构建了DNF5激酶结构域的Mg2+结合位点K391、ATP结合位点D484定点突变的载体：DNF5K391M-pKGWWRR、DNF5D484A-pKGWWRR，发现它们均不能够成功互补dnf5突变体，说明DNF5胞内激酶结构域激活所需要的Mg2+结合位点和ATP结合位点对DNF5整个蛋白的功能的发挥是必需的，由此推测DNF5蛋白发挥功能可能通过磷酸化激活下游底物，为详细解析DNF5蛋白信号通路提供参考。
4、为了进一步确定DNF5通过磷酸化激活下游底物，本研究开始聚焦DNF5蛋白胞内激酶区的自主激活。目前已经成功构建了3个以胞外结构域六个定点突变的DNF5为模板进行定点突变的DNF5-E-A-pointmutation-pKGWWRR载体和3个以缺失掉胞外结构域的DNF5为模板进行定点突变的DNF5-K-A-pointmutation-pKGWWRR载体。
本论文对蒺藜苜蓿DNF5蛋白结构域的功能进行了初步解析，对后续详细解析DNF5蛋白调控类菌体分化的机制提供帮助，对后续研究植物固氮共生提供新的思路参考。