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实验目的:1、通过活性筛选、高内涵筛选从中国产藤黄属植物的粗提物找寻可诱导细胞凋亡及调节自噬的活性成分;并通过活性导向的分离纯化，找到具有抗肿瘤且可调控自噬的活性化合物。2、针对活性化合物Oblongifolin C(OC)，利用蛋白质Fishing技术寻找其可能的蛋白质靶点;使用多种化学生物学手段验证OC与蛋白质的结合;在细胞水平检验OC对靶点蛋白质的相关功能的影响。 方法与结果:1、对14种中国产藤黄属植物的不同部位、不同溶剂提取获得76种粗提物样本进行活性筛选。(1)采用CCK-8法检测细胞增殖，结果提示大苞藤黄叶醇提物、山木瓜根皮醇提物、大果藤黄根皮醇提物和单花山竹子叶醇提物具有抑制肿瘤细胞增殖活性，其IC50值低于20μg/mL;(2)采用流式细胞术检测可见四种粗提物均能诱导G2/M期阻滞，并引起细胞凋亡;(3)利用稳定表达GFP-LC3的细胞模型及高内涵筛选(HCS)检测发现四种粗提物可诱导GFP-LC3点状分布，提示其有调节肿瘤细胞自噬水平的作用;(4)采用western blot法检测肿瘤细胞中目标蛋白表达水平变化，结果显示活性粗提物作用于肿瘤细胞能诱导凋亡相关蛋白的活性剪切，同时也能诱导LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ的转变，并且导致P62蛋白的累积;(5)用以上同样的方法，对分离纯化得到的单体化合物Neobractatin和Isobractatin进行了诱导凋亡以及调节细胞自噬能力检测，结果显示，两天然产物均能诱导肿瘤细胞凋亡，同时，也能显著诱导自噬小体的产生。2、利用Polysorb管将OC固定于管壁，并与细胞裂解液混合后通过质谱分析发现OC可与HSPA8、CTSB结合，进而研究其作用机制。(1)利用E.coli表达系统表达并纯化人HSPA8、CTSB蛋白;(3)利用等离子共振SPR结合Bicore确认OC与靶蛋白的结合;(4)利用蛋白质热转移技术检测OC与靶蛋白共孵育对蛋白Tm值的影响，提示OC的能使HSPA8的结构变得不稳定;(5)将OC结构修饰并合成OC-biotin，并利用OC-biotin验证了OC与靶蛋白间的结合。(6)针对HSP8A、CTSB在细胞中的功能，设计了多个实验证明了OC在细胞内的抑制机制。 结论:我们对14种中国产藤黄属植物的76种粗提物进行了抗肿瘤活性筛选，筛选出能诱导细胞凋亡并调节细胞自噬水平的活性粗提物。对活性化合物OC，我们找到了其两个蛋白质作用靶点，并利用多种手段验证了其作用机制。本研究为进一步开发中国产藤黄属植物的抗肿瘤活性成分提供了新的科学依据。