论文部分内容阅读
树鼩作为具有潜在应用价值的新型实验动物，是灵长类动物的近亲，日渐受到重视。通过前期高质量的树鼩基因组解析，全面获取了这一新型实验动物的遗传特性，解释了其用于人类疾病动物模型，尤其是病毒感染模型创建的遗传基础。通过对树鼩基因组分析，我们发现树鼩天然免疫系统基因中RIG-I基因缺失。RIG-I是细胞内识别病毒RNA的关键受体，它与线粒体接头蛋白MAVS（也称为Cardif、IPS-1或VISA）相互作用，诱导Ⅰ型干扰素产生，在抗病毒先天然免疫中发挥了重要的作用。树鼩基因组上该基因缺失，可能对抗病毒先天性免疫信号通路产生了影响，导致多种病毒可以感染树鼩，也可能因为有新的RIG-I功能替代物出现，（部分）补偿了其功能，导致目前某些病毒感染树鼩受到限制。 本论文基于RIG-I缺失，从RLR(RIG-I-like receptors)信号通路出发，进行较为系统的研究发现: 1.树鼩RIG-I基因的缺失是在中缅树鼩（Tupaia belangeri）中普遍存在的现象，并且该缺失是在树鼩进化成为独立物种过程中发生的。树鼩RIG-I的缺失，同一家族成员树鼩MDA5(tMDA5)受到了正选择，在树鼩原代肾细胞过表达tMDA5能有效的激活IRF3、NF-κB和IFN-β，并在仙台病毒(sendai virus，SeV)刺激下协同SeV诱导Ⅰ型干扰素的表达，且明显抑制Huh7.5.1细胞中丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)的复制。tMDA5受到正选择的位点是Lys188和Ala402，突变体功能实验证实tMDA5的抗病毒能力要强于未受到正选择的突变体tMDA5 K188Q和tMDA5 A402K，提示着树鼩中可能是tMDA5部分替代了树鼩RIG-I的功能，在细胞中发挥主要识别病毒的功能。 2.我们检测了树鼩RIG-I缺失后，RLR的唯一下游接头蛋白树鼩MAVS(tMAVS)在HCV感染后的功能变化。克隆和功能结果显示了tMAVS在结构和功能上的保守性。从HCV逃避先天性免疫的角度，我们比较了人MAVS(hMAVS)和tMAVS的异同点，从分子水平探讨树鼩作为丙型肝炎动物模型的可能性。在树鼩肝源性细胞中，HCV NS3/4A蛋白酶可与tMAVS共定位，并通过识别保守的第508位半胱氨酸切割tMAVS。tMAVS的第506位谷氨酸，虽然相对hMAVS不是保守的缬氨酸，但仍然支持NS3/4A对tMAVS的切割。出乎意料的是，HCV NS3/4A只能削弱IRF3介导诱导的IFN-β，并不影响NF-κB信号的传递，这也许可以解释树鼩HCV长期感染率低的现象。 3.我们深入研究了这条信号通路中另一个抗病毒通路必不可少的蛋白MITA（也称为STING/TMEM173/MPYS/ERIS）在树鼩抗病毒先天性免疫中的功能。我们克隆了树鼩MITA(tMITA)基因，意外发现tMITA存在两种不同的转录本，除全长的tMITA(tMITA-FL)外，还存在一个缺乏C末端的截断剪切突变体(tMITA-mini)，tMITA-mini在静息状态下表现出对tMITA-FL的抑制功能，发挥负调控子的功能。有趣的是，在抗病毒感染过程中，tMITA-FL主要表现出对HSV-1的抗病毒能力，而tMITA-mini则在不同RNA病毒刺激下表现出强烈的抑制VSV和HCV复制的能力。这些初步的实验结果提示着tMITA-FL和tMITA-mini分别在不同的信号通路中分别发挥抗病毒功能。 总之，我们深入探讨了树鼩先天性免疫RLR信号通路关键基因和分子调控机制，取得了一系列原创性结果，从先天性免疫的角度，证明了树鼩可以感染HCV，及树鼩RIG-I缺失后关键抗病毒蛋白功能的变化。研究结果将为树鼩病毒感染动物模型建立提供新的思路。