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目的：蛇六谷为天南星科魔芋属多年生草本植物的块茎，为中医临床常用的抗肿瘤中药，其主要有效成分葡甘露聚糖(KGM)的含量约占蛇六谷50%～60%，课题组前期研究发现，KGM能提高巨噬细胞的吞噬能力，促进细胞因子的释放，提高机体的免疫能力，具有明确的免疫抗肿瘤作用。巨噬细胞的极化是发挥免疫功能抗肿瘤的主要环节，靶向抑制M2型巨噬细胞分化、清除M2型巨噬细胞等措施已成为肿瘤治疗研究的重要领域之一，KGM免疫抗肿瘤作用是否通过影响巨噬细胞M1/M2亚型来发挥免疫调节作用尚未有相关报道。本研究拟以巨噬细胞株RAW264.7为研究对象，建立M1/M2亚型巨噬细胞极化模型，探讨KGM对巨噬细胞极化的调节作用，以及可能的相关信号通路，以期为KGM免疫抗肿瘤的相关药物研究提供科学依据。
方法：(1)巨噬细胞株RAW264.7体外培养，采用LPS(1μg/mL)+IFN-γ(20 ng/mL )诱导RAW264.7极化为M1亚型巨噬细胞，流式细胞术检测膜表面蛋白CD16/32、CD206的阳性表达率，实时荧光定量PCR检测TNF-α、iNOS、IL-1β、IL-6、IL-12、Fizz1、Arg1和TGF-βmRNA的相对表达量，验证M1极化模型的成功。(2)KGM干预极化成功的M1亚型巨噬细胞，流式细胞术检测KGM对巨噬细胞膜表面分子CD86、CD206阳性表达率的影响，ELISA方法检测炎症因子TNF-α、IL-1β分泌的情况，Griess法检测一氧化氮释放量，qRT-PCR方法考察KGM对M1亚型巨噬细胞相关细胞因子mRNA作用的影响，Westernblotting法检测KGM对M1亚型巨噬细胞NF-κB通路TLR4、Myd88、IKKα、P-IκBα、NF-κBP65和P-NF-κBp65蛋白表达的影响。(3)采用IL-4(20 ng/mL)诱导RAW264.7极化为M2亚型巨噬细胞，流式细胞术检测CD206和CD16/32的阳性表达率，qRT-PCR检测TNF-α、iNOS、IL-1β、Fizz1、Arg1和TGF-βmRNA等因子的相对表达量，验证M2极化模型的成功。(4)KGM干预极化成功的M2亚型巨噬细胞，流式细胞术检测KGM对巨噬细胞膜表面分子CD86、CD206的影响，ELISA方法检测IL-10和TGF-β炎症因子分泌的情况，qRT-PCR检测KGM对M2亚型巨噬细胞相关细胞因子mRNA的表达量，Westernblotting法检测KGM对M2亚型巨噬细胞JAK-STAT6通路IL-4Rα、STAT6、P-STAT6、SOCS1、KLF4、PPARγ和PPARδ蛋白表达的影响。
结果：(1)LPS(1μg/mL)+IFN-γ(20 ng/mL)可以有效地诱导巨噬细胞株RAW264.7极化为M1亚型巨噬细胞。经检测M1亚型特异性膜表面分子CD16/32的阳性表达率由46.58%上升到71.89%，M2亚型特异性膜表面分子CD206阳性表达率由10.65%下降到8.59%，均具有显著性差异(P＜0.01)；与对照组相比，M1亚型巨噬细胞特异性标志物IL-6、IL-12、IL-1β、iNOS和TNF-αmRNA表达量升高(P<0.05)，M2亚型巨噬细胞特异性标志物Fizz1和Arg1mRNA表达量降低(P<0.01)，验证了巨噬细胞M1亚型极化成功。(2)不同剂量的KGM干预极化成功的M1亚型巨噬细胞，与模型组比较，100μg/mLKGM能进一步升高M1亚型膜表面分子标志物CD86的表达，CD86的阳性表达率由59.87%上升到72.95%(P<0.01)，降低了M2亚型膜表面分子标志物CD206的表达，CD206的阳性表达率由10.40%下降到3.53%(P<0.01)；Griess结果显示，KGM能明显升高NO的表达，与模型组比较，有统计学差异(P<0.01)；ELISA结果显示，与模型组比较，KGM能够进一步诱导TNF-α和IL-1β的表达与释放(P<0.01)；qRT-PCR结果表明100μg/mLKGM能有效的增加M1型巨噬细胞标志性细胞因子TNF-α、iNOS、IL-6、IL-1β和IL-12mRNA的表达(P<0.01)，降低M2型巨噬细胞标志性细胞因子Fizz1与Arg1mRNA的表达(P<0.01)，初步表明KGM能增强M1亚型巨噬细胞的活性，诱导M2亚型巨噬细胞向M1型转变。Westernblotting结果显示LPS与IFN-γ激活TLR4/Myd88信号转导介导的NF-κB途径，经KGM干预后，100μg/mLKGM能促进NF-κB通路相关蛋白IKKα和P-IκBα蛋白的表达(P<0.01)，促进NF-κB从胞浆游离出来转运到细胞核内，能有效激活TLR4/Myd88信号转导介导的NF-κB途径。(3)IL-4(20 ng/mL)可以有效地诱导RAW264.7极化为M2亚型巨噬细胞。M2亚型特异性膜表面分子CD206阳性表达率由7.19%上升到48.62%(P＜0.01)，M1亚型特异性膜表面分子CD16/32的阳性表达率由40.87%下降到28.31%(P＜0.01)；M2亚型巨噬细胞特异性标志物Arg1、TGF-β、Fizz1mRNA的表达升高(P<0.05)，M1亚型巨噬细胞特异性标志物TNF-α、iNOS和IL-12mRNA的表达降低(P<0.05)，验证M2亚型巨噬细胞极化成功。(4)不同剂量的KGM干预极化成功的M2亚型巨噬细胞，与模型组比较，100μg/mLKGM降低M2亚型膜表面分子标志物CD206的表达，CD206的阳性表达率由33.04%下降到14.97%(P<0.01)，升高了M1亚型膜表面分子标志物CD86的表达，CD86的阳性表达率由39.63%上升到55.46%(P<0.01)；ELISA结果显示，KGM降低了细胞因子IL-10和TGF-β的表达与释放，与模型组比较，均具有显著性差异(P<0.01)；qRT-PCR结果表明，相比较于模型组，KGM组能有效的增加M1型巨噬细胞标志性细胞因子TNF-α、iNOS和IL-6mRNA的表达(P<0.01)，降低M2型巨噬细胞标志性细胞因子Fizz1mRNA的表达(P<0.01)，进一步证明KGM能增强M1亚型巨噬细胞的活性，诱导M2型向M1型转化；Westernblotting结果显示IL-4通过JAK-STAT6通路诱导M2型巨噬细胞的活化，KGM抑制了这一进程，降低了JAK-STAT6信号通路相关蛋白IL-4Rα、SOCS1、P-STAT6、KLF4、PPARγ和PPARδ的表达，差异均具有统计学意义(P<0.01)，JAK-STAT6可能是KGM抑制M2亚型巨噬细胞活化的潜在机制。
结论：KGM对活化的小鼠巨噬细胞RAW264.7的M1和M2亚型均具有免疫调节作用，能够进一步促进M1亚型巨噬细胞的活化，抑制M2亚型巨噬细胞的活化，增强M1亚型巨噬细胞的免疫调节功能，促进M2亚型巨噬细胞向M1表型转变。KGM调节M1亚型巨噬细胞的潜在机制可能为TLR/Myd88/NF-κB途径，JAK-STAT6途径可能参与KGM调节M2亚型巨噬细胞的免疫抑制作用。
方法：(1)巨噬细胞株RAW264.7体外培养，采用LPS(1μg/mL)+IFN-γ(20 ng/mL )诱导RAW264.7极化为M1亚型巨噬细胞，流式细胞术检测膜表面蛋白CD16/32、CD206的阳性表达率，实时荧光定量PCR检测TNF-α、iNOS、IL-1β、IL-6、IL-12、Fizz1、Arg1和TGF-βmRNA的相对表达量，验证M1极化模型的成功。(2)KGM干预极化成功的M1亚型巨噬细胞，流式细胞术检测KGM对巨噬细胞膜表面分子CD86、CD206阳性表达率的影响，ELISA方法检测炎症因子TNF-α、IL-1β分泌的情况，Griess法检测一氧化氮释放量，qRT-PCR方法考察KGM对M1亚型巨噬细胞相关细胞因子mRNA作用的影响，Westernblotting法检测KGM对M1亚型巨噬细胞NF-κB通路TLR4、Myd88、IKKα、P-IκBα、NF-κBP65和P-NF-κBp65蛋白表达的影响。(3)采用IL-4(20 ng/mL)诱导RAW264.7极化为M2亚型巨噬细胞，流式细胞术检测CD206和CD16/32的阳性表达率，qRT-PCR检测TNF-α、iNOS、IL-1β、Fizz1、Arg1和TGF-βmRNA等因子的相对表达量，验证M2极化模型的成功。(4)KGM干预极化成功的M2亚型巨噬细胞，流式细胞术检测KGM对巨噬细胞膜表面分子CD86、CD206的影响，ELISA方法检测IL-10和TGF-β炎症因子分泌的情况，qRT-PCR检测KGM对M2亚型巨噬细胞相关细胞因子mRNA的表达量，Westernblotting法检测KGM对M2亚型巨噬细胞JAK-STAT6通路IL-4Rα、STAT6、P-STAT6、SOCS1、KLF4、PPARγ和PPARδ蛋白表达的影响。
结果：(1)LPS(1μg/mL)+IFN-γ(20 ng/mL)可以有效地诱导巨噬细胞株RAW264.7极化为M1亚型巨噬细胞。经检测M1亚型特异性膜表面分子CD16/32的阳性表达率由46.58%上升到71.89%，M2亚型特异性膜表面分子CD206阳性表达率由10.65%下降到8.59%，均具有显著性差异(P＜0.01)；与对照组相比，M1亚型巨噬细胞特异性标志物IL-6、IL-12、IL-1β、iNOS和TNF-αmRNA表达量升高(P<0.05)，M2亚型巨噬细胞特异性标志物Fizz1和Arg1mRNA表达量降低(P<0.01)，验证了巨噬细胞M1亚型极化成功。(2)不同剂量的KGM干预极化成功的M1亚型巨噬细胞，与模型组比较，100μg/mLKGM能进一步升高M1亚型膜表面分子标志物CD86的表达，CD86的阳性表达率由59.87%上升到72.95%(P<0.01)，降低了M2亚型膜表面分子标志物CD206的表达，CD206的阳性表达率由10.40%下降到3.53%(P<0.01)；Griess结果显示，KGM能明显升高NO的表达，与模型组比较，有统计学差异(P<0.01)；ELISA结果显示，与模型组比较，KGM能够进一步诱导TNF-α和IL-1β的表达与释放(P<0.01)；qRT-PCR结果表明100μg/mLKGM能有效的增加M1型巨噬细胞标志性细胞因子TNF-α、iNOS、IL-6、IL-1β和IL-12mRNA的表达(P<0.01)，降低M2型巨噬细胞标志性细胞因子Fizz1与Arg1mRNA的表达(P<0.01)，初步表明KGM能增强M1亚型巨噬细胞的活性，诱导M2亚型巨噬细胞向M1型转变。Westernblotting结果显示LPS与IFN-γ激活TLR4/Myd88信号转导介导的NF-κB途径，经KGM干预后，100μg/mLKGM能促进NF-κB通路相关蛋白IKKα和P-IκBα蛋白的表达(P<0.01)，促进NF-κB从胞浆游离出来转运到细胞核内，能有效激活TLR4/Myd88信号转导介导的NF-κB途径。(3)IL-4(20 ng/mL)可以有效地诱导RAW264.7极化为M2亚型巨噬细胞。M2亚型特异性膜表面分子CD206阳性表达率由7.19%上升到48.62%(P＜0.01)，M1亚型特异性膜表面分子CD16/32的阳性表达率由40.87%下降到28.31%(P＜0.01)；M2亚型巨噬细胞特异性标志物Arg1、TGF-β、Fizz1mRNA的表达升高(P<0.05)，M1亚型巨噬细胞特异性标志物TNF-α、iNOS和IL-12mRNA的表达降低(P<0.05)，验证M2亚型巨噬细胞极化成功。(4)不同剂量的KGM干预极化成功的M2亚型巨噬细胞，与模型组比较，100μg/mLKGM降低M2亚型膜表面分子标志物CD206的表达，CD206的阳性表达率由33.04%下降到14.97%(P<0.01)，升高了M1亚型膜表面分子标志物CD86的表达，CD86的阳性表达率由39.63%上升到55.46%(P<0.01)；ELISA结果显示，KGM降低了细胞因子IL-10和TGF-β的表达与释放，与模型组比较，均具有显著性差异(P<0.01)；qRT-PCR结果表明，相比较于模型组，KGM组能有效的增加M1型巨噬细胞标志性细胞因子TNF-α、iNOS和IL-6mRNA的表达(P<0.01)，降低M2型巨噬细胞标志性细胞因子Fizz1mRNA的表达(P<0.01)，进一步证明KGM能增强M1亚型巨噬细胞的活性，诱导M2型向M1型转化；Westernblotting结果显示IL-4通过JAK-STAT6通路诱导M2型巨噬细胞的活化，KGM抑制了这一进程，降低了JAK-STAT6信号通路相关蛋白IL-4Rα、SOCS1、P-STAT6、KLF4、PPARγ和PPARδ的表达，差异均具有统计学意义(P<0.01)，JAK-STAT6可能是KGM抑制M2亚型巨噬细胞活化的潜在机制。
结论：KGM对活化的小鼠巨噬细胞RAW264.7的M1和M2亚型均具有免疫调节作用，能够进一步促进M1亚型巨噬细胞的活化，抑制M2亚型巨噬细胞的活化，增强M1亚型巨噬细胞的免疫调节功能，促进M2亚型巨噬细胞向M1表型转变。KGM调节M1亚型巨噬细胞的潜在机制可能为TLR/Myd88/NF-κB途径，JAK-STAT6途径可能参与KGM调节M2亚型巨噬细胞的免疫抑制作用。