论文部分内容阅读
百萨偃麦草高分子量麦谷蛋白亚基基因的克隆及其遗传转化通过SDS-PAGE电泳和Western杂交,在百萨偃麦草(Thinopyrumbessarabicum)中鉴定出一个高分子量麦谷蛋白亚基,本研究将该亚基命名为1Ebx,编码基因为Glu-1Ebx。对由百萨偃麦草衍生的一套二体附加系进行SDS-PAGE分析和PCR分析表明,1Ebx亚基是由百萨偃麦草1Eb染色体上的HMW-GS基因所编码。
利用一对HMW-GS基因兼并性引物,从二倍体百萨偃麦草基因组DNA中扩增出1800bp左右的DNA片段。采用定向嵌套缺失的方法获得了一系列定向缺失体,测序后拼接成基因全序列。该基因序列已经登陆GeneBank,序号为:AY525782。该基因具有典型的小麦HMW-GS基因的序列结构特征,包括信号肽、N-端、C-端和中央重复区等4个部分。该HMW-GS基因为x-型亚基。序列比较结果表明,Glu-1Ebx基因与长穗偃麦草x-型亚基及小麦Bx亚基的同源性更高。通过IPTG诱导,Glu-1Ebx基因在Ecoli中表达了HMW-GS蛋白。SDS-PAGE分析表明,该蛋白与百萨偃麦草种子的HMW-GS迁移率一致。用HMW-GS多克隆抗体进行检测,细菌表达蛋白和种子蛋白均表现阳性杂交信号。
将Glu-1Ebx基因克隆到胚乳特异性表达启动子pGlu-Dx5下,构建植物表达质粒,并和pAHC25用基因枪轰击的方法共转化受体小麦品种Bobwhite幼胚。Southern和Northern杂交表明,获得了2个转基因植株03LH-11和04LH-9。
SDS-PAGE分析表明,T0代03LH-11的所有9粒种子中8粒其所有的高分子量麦谷蛋白亚基都缺失,这不仅包括Bobwhite内源的五个亚基,而且转化的Glu-1Ebx基因也未表达。另1粒只是Glu-1Ebx转基因未表达。T1代中03LH-11-1HMW-GS基因全部沉默,而03LH-11-2后代出现内源HMW-GS基因沉默与表达3:1的分离。表明这种沉默是可以稳定遗传的。以03LH-11-1为亲本之一的4个杂交组合37粒杂种种子的HMW-GS全部沉默。Western杂交证实了SDS-PAGE的结果。
T1代转基因沉默植株RT-PCR分析表明,不同的HMW-GS基因扩增水平各不相同。Glu-1Dy10基因没有扩增,而Glu-1Ebx基因正常扩增。Glu-1Ax2*、Glu-1Bx7、Glu-1By9和Glu-1Dx5基因扩增情况类似,在40循环下,有微弱的扩增,而在35循环下均未见扩增,表明它们的mRNA表达水平受到了很大程度的抑制。利用HpaⅡ-MspⅠ一对同裂酶进行Southern杂交,分析转基因植株甲基化状态。在所分析的4个基因中均有不同程度甲基化现象。从T1代转基因沉默植株未成熟种子总RNA中获得smallRNA,并进行siRNA的Northern杂交。结果表明转基因沉默植株有两个特异性smallRNA阳性杂交片段,分子量大小估计在20-25nt之间。这说明HMW-GS基因沉默与干涉RNA(siRNA)有关。
簇毛麦6V染色体多态性研究来自英国剑桥植物园的簇毛麦(J-簇毛麦)基因组已经转移到小麦中,并培育出6AL/6VS抗白粉病易位系,其抗病基因已被命名为Pm21。来自前苏联的簇毛麦(S-簇毛麦)基因组也成功地转移到小麦中,并培育出6DL/6VS抗白粉病易位系。本研究进行了醇溶蛋白指纹图谱及其RFLP标记研究,旨在筛选与Pm97033等易位系中抗病白粉病基因连锁的分子标记;比较两个不同来源簇毛麦6V染色体的多态性,尤其是抗病基因载体6VS的差异。
种子醇溶蛋白分析表明,所有含有S-簇毛麦6VS染色体的品系在α/β区均有一条不同于普通小麦的特征带(Gli-Vs2)。分析了Pm97033×藁8901F2分离群体醇溶蛋白图谱,表明Gli-Vs2与抗白粉病基因共分离。J-簇毛麦和它的衍生抗病系在α/β区也拥有一条特征带Gli-VJ2,但其电泳迁移率小于Gli-Vs2蛋白。因此这两个醇溶蛋白可以作为区别两个来源不同簇毛麦6VS染色体及其所携带抗病基因的生化标记。6AL/6VS×6DL/6VSF2分离群体分析表明,Gli-Vs2和Gli-VJ2两个生化标记为共显性遗传。观察到两个簇毛麦在α、β、γ及ω区都有明显的多态性条带。
选用小麦第六同源群长臂和短臂着丝点附近的两个探针psr371和psr113,远着丝粒端的两个探针psr546和psr8进行RFLP分析。结果表明Pm97033等三个易位系是由6VS取代6DS而形成的6DL/6VS易位,其易位断点在着丝粒上或附近,为罗伯逊式(Robertson)易位。
选用psr113、psr312、psr141、psr106、psr627、psr8和psr964等RFLP探针,从着丝点到6S染色体端部不同位置,分析两个簇毛麦6VS染色体多态性。结果表明这些探针都能杂交出簇毛麦第六部分同源群6VS特异性DNA片段,而且两个簇毛麦及其相应抗病系之间也存在着RFLP多态性。Psr371、psr546、CDO772、ABG474和psr915等长臂探针都能杂交出6V染色体长臂的特异性DNA片段,并揭示出两个簇毛麦及其衍生抗病系之间各有特异性DNA杂交片段。有些探针/酶切组合只能在簇毛麦中杂交出DNA片段,但在其它6V遗传材料中不能杂交出对应的DNA片段,表明这些标记在6V染色体没有同源性DNA片段。
上述结果表明两个不同来源的簇毛麦在遗传上具有多态性。