论文部分内容阅读
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS),又被称为蓝耳病,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS Virus,PRRSV)引起的一种危害养猪业的病毒性传染病,主要引起母猪的繁殖障碍、公猪的精液品质下降、初生仔猪的死亡以及其它年龄猪的呼吸系统疾病。天然免疫是宿主抵抗病毒感染的第一道防线,但在与宿主的共进化过程中,病毒往往会发展各种机制抵抗宿主的天然免疫,达到成功感染的目的。以前的研究表明,PRRSV感染能够拮抗I型干扰素(Interferons,IFNs)的产生,而且PRRSV编码的多种蛋白,包括非结构蛋白nsp1,nsp2,nsp4,nsp11和结构蛋白N蛋白,具有拮抗干扰素产生的能力,但其分子机制尚不完全清楚。N蛋白是PRRSV编码的核衣壳蛋白,也是PRRSV的主要结构蛋白,在PRRSV的感染、致病和免疫调节中扮演着十分重要的作用。本研究针对PRRSV N蛋白,探讨其拮抗IFN-β产生的分子机制,主要研究内容如下:1.超表达PRRSV N蛋白抑制IFN-β产生和IRF3激活将PRRSV N蛋白的真核表达质粒转染HEK293T细胞,在仙台病毒(Se V)的刺激下,采用IFN-β启动子的双荧光素酶报告系统检测IFN-β的产生,发现超表达PRRSV N蛋白显著抑制IFN-β的启动子激活。IRF3是干扰素信号通路中最关键的转录因子,我们采用同样的策略分析了N蛋白对IRF3的影响,发现超表达N蛋白也显著抑制IRF3激活,并且呈剂量依赖性。2.PRRSV N蛋白作用于RIG-I/MDA5信号通路的靶点分析RIG-I/MDA5信号通路在RNA病毒激活干扰素产生中具有十分重要的作用。为了研究PRRSV N蛋白是否拮抗RIG-I/MDA5信号通路以及其作用的靶点,通过共转染PRRSV N蛋白的真核表达质粒和RIG-I/MDA5通路中各受体分子(RIG-I、MDA5)、接头蛋白(IPS-1)、蛋白激酶(TBK-1、IKKε)和转录因子(IRF3)的真核表达质粒,利用双荧光素酶系统检测IFN-β的启动子活性。结果表明,PRRSV N蛋白可以拮抗RIG-I、MDA5、IPS-1、TBK-1、IKKε和IRF3介导的IFN-β启动子激活。更重要的是,PRRSV N蛋白还可以拮抗IRF3显性突变体IRF3-5D介导的IFN-β启动子激活,提示PRRSV作用RIG-I/MDA5通路的靶点在IRF3或IRF3下游。通过间接免疫荧光实验进一步分析了N蛋白的亚细胞定位,发现PRRSV N蛋白呈现细胞质和细胞核穿梭分布,表明其具有在细胞核内靶向IRF3的可能。3.PRRSV N蛋白抑制IFN-β产生的关键功能域分析为了确定PRRSV N蛋白抑制IFN-β产生的关键结构域,通过IFN-β启动子的双荧光素酶报告系统,分别检测了N蛋白的不同区域缺失突变体(6个N-端缺失突变体和5个C-端缺失突变体)抑制IFN-β产生的能力。结果显示:PRRSV N蛋白的aa37-57和aa69-123是抑制Se V诱导的IFN-β激活的关键区域,而aa37-57正好包含N蛋白的核定位信号序列。