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附红细胞体病是由附红细胞体(Eperythrozoon)寄生于多种动物的红细胞表面、血浆及骨髓中引起的一种人畜共患病。关于附红细胞体的分类地位目前仍有争议,传统的分类学方法将附红细胞体列为立克次氏体,但是近年来16S rRNA基因的系统发育分析的结果表明,附红细胞体更接近于支原体(Mycoplasma)。猪的附红细胞体病主要引起仔猪发热、贫血苍白、黄疸和母猪流产等症状,常与其他猪病混合感染危害严重,防治十分困难,给养猪业造成巨大经济损失。 直接镜检是目前临床上诊断该病的主要手段,包括鲜血压片和涂片染色,但该方法假阳性较多见。动物实验是确诊的手段之一,但所费时间太久。血清学诊断方法包括间接血凝试验(IHA)、补体结合试验(CFT)和酶联免疫吸附试验(ELISA)等,但由于附红细胞体抗体水平的变化没有规律而常出现假阴性的结果。鉴于上述原因,为了建立特异准确的诊断方法,本研究开展了附红细胞体病的聚合酶链式反应(PCR)诊断方法的研究。 根据已报道的附红细胞体基因组的序列(序列号AJ504999)设计了一对引物,建立了特异性的聚合酶链式反应,扩增片段大小为782bp,然后将扩增产物测序,测序结果与GenBank上猪附红细胞体序列进行同源性比较,同源性达到99%。特异性试验表明只有猪附红细胞体模板可以扩增出特异性条带,而健康猪血液、弓形虫、猪伪狂犬病毒、多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌样品没有该条带。利用建立的PCR方法对湖北、河南省的15个猪场进行了PCR检测,结果有8个猪场为阳性,阳性率最高的达到83.3%,平均阳性率为26.4%。在此基础上又设计了一条引物,建立了半巢式PCR,敏感性试验结果表明最低检测出0.061fg的质粒DNA浓度。本研究建立的猪附红细胞体病PCR诊断方法为附红细胞体的体外培养、病原学研究及该病的诊断和致病机理的研究等奠定了基础。 本研究还对摘除脾脏的猪感染猪附红体,进行了试验性猪附红细胞体病的研究。感染猪出现了皮肤发红、出现紫斑、眼睑肿胀、体温升高等症状。试验猪感染E.suis后红细胞数量、血红蛋白数没有明显变化,表明贫血不明显;葡萄糖有显著降低;血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶都有升高的趋势;半巢式PCR方法从接种后第1d起即可监测到,持续到试验结束。但利用姬姆萨涂片染色监测染虫率没有明显上升。