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鸡球虫病是养禽生产中一种分布广泛、危害严重的原虫病。目前为止鸡球虫病的防控主要以化学药物为主。但随着这些抗球虫药的普遍使用,新的问题不断暴露出来,鸡球虫的耐药性、抗球虫药的药物残留、动物源食品安全问题让兽医科技工作者陷入了更大的困扰。随着科对球虫免疫机理研究的不断深入,研究人员将眼光放在了球虫疫苗的研发上。本研究通过免疫蛋白质组学的方法研究不同种鸡球虫的免疫原性抗原,旨在发现一批具有良好免疫原性的,3种球虫之间的共同抗原,并对这些共同抗原抵抗多种球虫混合感染的效果进行评估,为临床上鸡球虫的混合感染的预防提供参考。1柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫孢子化卵囊的免疫蛋白组学分析采用免疫蛋白组学的方法,对E.tenella（柔嫩艾美耳球虫）、E.acervulina.（堆型艾美耳球虫）和E.maxima（巨型艾美耳球虫）三种鸡球虫的可溶性蛋白进行了免疫蛋白组学的分析。通过对3种球虫孢子化卵囊蛋白的2-D电泳分析,分别检测到626个E.acervulina蛋白点,632个E.maxima蛋白点和629个E.tenella蛋白点。通过Western blot 分析,E.tentlla、E.anervulina和E.maxina 分别有 50 个、64 个和 57 个蛋白点能被鸡球虫抗血清识别。质谱分析结果显示112个蛋白点对应了 96种蛋白,其中烯醇化酶2,延长因子2,乳酸脱氢酶,3-磷酸甘油醛脱氢酶,14-3-3蛋白,微线蛋白2,遍在蛋白缀合酶结构域等一些已知蛋白被检索到。59个点检索没有结果。基于免疫原性蛋白的的在线分析与序列比对,将核苷酸序列同源性在3个种之间在91%以上的抗原确定为共同抗原,最终我们得到延长因子2、遍在蛋白缀合酶结构域、14-3-3蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶四种共同抗原。2两种共同抗原基因克隆及真核表达质粒的构建选取了 ubiquitin-conjugating enzyme domain-containing protein,putative[Eimeria acervulina]和14-3-3 protein,putative[Eimeria acervulina]两个蛋白的基因对其克隆。根据它们的GenBank中收录的核苷酸序列设计特异性引物。以堆型艾美耳球虫的cDNA作为模板,对上述共同抗原基因进行PCR扩增,分别扩增出了 444bp、837bp的片段,将扩增产物连接入pVAX1.0载体中,对阳性克隆进行双酶切鉴定,并送至公司进行序列测定,并将测序的结果进行在线比对。结果显示双酶切鉴定切下了 450、900bp左右的条带,与预期目的条带大小一致,序列测定结果显示所得的核苷酸序列与GenBank中登陆的核苷酸序列（XM013391686,XM013394831）同源性为100%,表明已经成功克隆出了共同抗原基因EaUCE和Ea14-3-3,并且成功构建了真核表达质粒 pVAX-EaUCE 和 pVAX-Ea14-3-3。3真核表达质粒pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3诱导T淋巴细胞亚类反应和细胞因子变化用100μg真核表达质粒pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3经腿部肌肉注射免疫14日龄雏鸡,一周后加强免疫。首次免疫后7天和加强免疫后7天,分别分离鸡脾脏淋巴细胞,用流式细胞术检测CD4+/CD3+、CD8+/CD3+的比例。结果发现首免后第7天和2次免疫后7天,重组质粒免疫组的的脾脏T淋巴细胞水平显著高于PBS和pVAX1空质粒对照组（P<0.05）。结果表明,共同蛋白真核表达质粒能够有效地诱导鸡T淋巴细胞反应。用实时荧光定量PCR方法,检测脾脏中IFN-γ、IL-2、IL-4、TNFSF15、IL-17D和TGF-βmRNA水平。结果发现,首免7天后和2次免疫第7天后,与PBS和空载体对照组相比,重组质粒免疫组鸡脾脏IFN-γ、IL-2、TNFSF15、IL-17D和TGF-βmRNA 水平显著升高（P<0.05）,表明共同抗原蛋白真核表达质粒能够有效地诱导鸡体内细胞因子分泌。4真核表达质粒pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3诱导的抗体反应使用2种构建的pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3真核表达质粒免疫14日龄雏鸡,对照组为PBS组和pVAX1空质粒组。21日龄时,以同样剂量进行二免。一周后心脏采血,分离血清。每隔一周心脏采血一次,持续6周。用堆型艾美耳球虫孢子化卵囊可溶性蛋白作为包被抗原。通过间接ELISA方法检测血清中IgG水平。结果表明,加强免疫后第一周到第六周,pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3组抗体滴度显著高于PBS组和pVAX1空质粒组。免疫组抗体滴度从第一周到第三周缓慢上升,并在第四周左右到达高峰,之后抗体滴度逐渐下降。而PBS组和pVAX1空质粒组均未检测到特异性抗体。试验表明,构建的真核表达质粒pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3均能诱导鸡产生特异性抗体。5真核表达质粒pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3的免疫保护性研究将本试验所构建的pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3分别于14日龄雏鸡腿部肌肉注射100μg真核表达质粒pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3,21日龄加强免疫。对照组注射PBS和pVAX1空质粒。28日龄,除非免疫非攻虫组外,其余分别经口接种新鲜的E.tenella、E.acervulina、E.maxima和混合孢子化卵囊。6天后剖杀所有实验鸡,对增重、肠道内容物卵囊数、肠道病变记分和抗球虫指数（ACI）等指标进行统计。结果发现 pVAX-Ea14-3-3 免疫组,在感染E.tenella、E.acervulina、E.maxima和混合孢子化卵囊后,每组的ACI均大于160,说明真核表达质粒pVAX-Ea14-3-3能够对E.tenella、E.acervulina、E.maxima和混合孢子化卵囊的感染起到良好的免疫保护效果;真核表达质粒pVAX-EaUCE免疫组相比对照组,肠道病变值、卵囊数有所降低,鸡的相对增重率比对照组要高,这说明我们构建的真核表达质粒pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3不仅能够抵抗单种鸡球虫的感染,而且能够抵抗三种球虫的混合感染。